遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构和多样性的影响

2019-11-07罗艺岚赵东豪孙鹏越高金柱呼天明付娟娟

草地学报 2019年5期

罗艺岚，赵东豪，孙鹏越，高金柱，呼天明，付娟娟

(西北农林科技大学草业与草原学院，陕西杨凌 712100)

在城市园林绿化中，常采用乔、灌、草三者相结合的方式[1]，这给草坪带来无法避免的遮阴胁迫。遮阴导致蓝光和红光比例增加，空气流通减缓使小环境湿度升高，空气和土壤表层温度发生改变，进而影响草坪的坪用特性[2]。长期处于阴蔽的环境下，给草坪草的生长带来诸多不利的影响。长期遮阴导致草坪草生长瘦弱细小[3]，遮阴导致叶面积增大，叶片厚度降低，叶片解剖结构改变[4]，且难以抵抗践踏、病虫害、低温、干旱等生物与非生物逆境胁迫伤害，从而降低草坪的质量[5,6]。对遮阴胁迫下高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)的研究发现，遮阴增加了胞间CO2浓度，降低了叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、呼吸速率和光反应系统II的最大光化学效率等，从而抑制高羊茅的光合作用[7]。Li等[8]研究也发现遮阴胁迫影响植物的正常生长，一方面表现为分配到叶的生物量增加，而分配到同化枝的生物量降低；另一方面，遮阴导致同化枝的直径和叶厚度降低，而促进同化枝的长度和叶面积的增加。

由于遮阴引起土壤表层温度和湿度改变，这些改变会引起土壤理化性质和微生物群落结构及其多样性发生相应的变化。然而，目前关于草坪草根际土壤微生物群落对遮阴胁迫响应机理的研究鲜有报道。本试验以耐阴性强的麦冬和不耐阴的多年生黑麦草为研究对象，分别采集其遮阴胁迫下的根际土壤，通过16S rRNA高通量测序平台，研究遮阴对其根际土壤细菌群落组成、多样性等方面的影响，并分析土壤理化因子对其根际土壤微生物群落结构的影响，揭示麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落对遮阴胁迫的响应机制。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为耐阴性强的麦冬(Ophiopogonjaponicus(Linn. f.) Ker-Gawl.,缩写为OJ)和耐阴性较差的多年生黑麦草(LoliumperenneL. ‘ph.D.’，缩写为LP)。

供试草坪建植于2007年，于2017年10月在西北农林科技大学麦冬和多年生黑麦草草坪(34°17′25″ N，108°4′1″ E，海拔539.2 m)采用五点取样法采集土壤样品。土壤样品的基本理化性状见表1。

1.2 试验设计

本试验在日光温室进行，待植株长至15 cm时，采用遮阴布进行遮阴处理，以在正常条件下生长为对照。麦冬和多年生黑麦草分别设置2个遮阴梯度，分别为未处理的多年生黑麦草(LP.0d)、遮阴处理7 d的多年生黑麦草(LP.S.7d)、遮阴处理14 d的多年生黑麦草(LP.S.14d)、正常条件生长7 d的对照组多年生黑麦草(LP.L.7d)、正常条件生长14 d的对照组多年生黑麦草(LP.L.14d)；未处理的麦冬(OJ.0d)、遮阴处理7 d的麦冬(OJ.S.7d)、遮阴处理14 d的的麦冬(OJ.S.14d)、正常条件生长7 d的对照组麦冬(OJ.L.7d)和正常条件生长14 d的对照组麦冬(OJ.L.14d)。每个处理6盆(13.5 cm×17.5 cm×11.0 cm)，每盆15株，总计60盆，分别于遮阴处理7 d和14 d后，每盆取样3株，采用抖土法[9]采集其根际土壤样品，过筛(孔径2 mm)后装入冰盒后带回实验室，置于灭菌的离心管中，冻存于—80℃冰箱，用于根际土壤细菌16S rRNA测序分析。其余土壤鲜土样品去除植物根系、枯枝落叶等杂物，一部分鲜土样用于测定土壤铵态氮和硝态氮含量，另一部分风干研磨后过筛(孔径0.25 mm)，聚乙烯袋中密封保存，用于测定土壤pH、全氮、全磷、全钾、有机质等。

1.3 测定方法

1.3.2土壤DNA的提取、PCR扩增以及16S rRNA基因的高通量测序土壤总DNA的提取使用美国MoBio公司的Power Soil DNA Extraction Kit试剂盒(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)，每个土壤样品称取0.3 g，依据试剂盒说明提取土壤总DNA。采用引物F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和R806(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)[11]扩增土壤微生物16S rRNA基因V4区。经纯化后的双端序列送至深圳华大基因研究院(Shenzhen Huada Gene Research Institute,BGI)利用Illumina HiSeq2500测序平台进行Paired-end测序。

1.3.3数据的分析处理测序所得结果使用FLASH (v1.2.11)软件[12]进行序列过滤，去除掉长度小于15 bp和错配碱基数>0.1的序列。并运用UCHIME(v4.2.40)[13]的方法去除USEARCH GLOBAL数据库中的嵌合体序列。OTU (Operational Taxonomic Units)聚类分析通过USEARCH(v7.0.1090)方法[14]对序列按相似度0.97进行聚类，并通过USEARCH GLOBAL方法选取每个类中的代表序列[15]。对比USEARCH GLOBAL数据库，采用Ribosomal Database Project(RDP)(v.2.2)分类方法得到每个OTU的物种分类信息。利用Mothur(v1.31.2)软件进行α多样性分析(包括Sob指数、Chao指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数)。基于Bray-Curtis距离，使用QIIME(v1.80)软件进行β多样性分析。使用vegan(v2.4.2)软件进行Mantel检验(9,999 permutations)和典型相关分析(Canonical Correlation Analysis,CCA)对土壤理化性质和根际土壤细菌群落组成作相关性分析。Kruskal-Wallis检验用于分析土壤微生物组成对遮阴胁迫的响应。采用SPSS 19.1 软件进行ANOVA分析，用LSD法分析遮阴对土壤理化性质影响的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 遮阴胁迫对土壤理化性质的影响

如表1所示，遮阴胁迫导致土壤理化性质发生改变。与对照相比，遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤的硝态氮含量都显著增加(P<0.05)，而TP，TK和AK含量降低，其中多年生黑麦草降低趋势更为显著。遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草土壤铵态氮和AP含量的影响存在显著差异，表现为遮阴胁迫显著降低麦冬土壤铵态氮的含量，增加AP的含量(P<0.05)，而对多年生黑麦草土壤的影响却恰恰相反。遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草土壤TN含量、有机碳(Organic C)含量、碳氮比(C∶N ratio)以及pH值的影响不显著。

表1 遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤的理化性质

注：OJ：麦冬(Ophiopogonjaponicus(Linn. f.) Ker-Gawl.)；LP：多年生黑麦草(LoliumperenneL.)；OJ.0d和LP.0d：处理0 d；OJ.L.7d和LP.L.7d：正常光照生长7 d；OJ.L.14d和LP.L.14d：正常光照生长14 d；OJ.S.7d和LP.S.7d：遮阴处理7 d；OJ.S.14d 和LP.S.14d：遮阴处理14 d；表中数据表示六个重复的平均值；表中同列不同行的不同字母表示差异显著(***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)，下同

Note:OJ.0d and LP.0d indicates Control (0 d);OJ.S.7d and LP.S.7d indicates shade for 7 d;OJ.S.14d and LP.S.14d indicates shade for 14 d;OJ.L.7d and LP.L.7d indicates light (sunny) for 7 d;OJ.L.14d and LP.L.14d indicates light (sunny) for 14 d. Values are the means of six pot replicates. Different lowercase or capital letters indicate significant differences (P< 0.05,LSD test) in OJ (Ophiopogonjaponicus,shade tolerant) or LP (Loliumperenne, shade-intolerant) soil. (***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05). The same as below

2.2 OTU聚类与多样性分析

ACE指数、Sob指数和Chao指数反映样品中群落的丰富度，而Shannon指数和Simpson指数反映群落的多样性。不同处理的ACE指数为5 817.98～6 039.97，Chao指数为5 774.20～6 007.40，Sob指数为4 539.17～4 726.67，香浓指数为6.61～6.86，辛普森指数为0.0057～0.0107(表2)。遮阴胁迫不同程度地改变麦冬和多年生黑麦根际土壤细菌群落的α多样性。Kruskal-Wallis检验分析结果表明，遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落的ACE指数、Chao指数、Sob指数和香浓指数均没有显著影响(P>0.05)，但是显著影响其辛普森指数。遮阴胁迫下麦冬根际土壤细菌群落的辛普森指数较对照增加，而多年生黑麦草根际土壤细菌群落则呈现相反变化趋势(表2)。

表2 遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落α多样性统计

注：表中同列不同行的不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note:Different lowercase or capital letters indicate significant differences (P<0.05,Kruskal-Wallis test)

主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)对细菌群落结构变异的解释量为64.06%(图1)。麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落单独聚类。麦冬根际土壤的细菌群落基本都在第一、四象限，其中不进行遮阴处理(OJ.L.14d和OJ.L.7d)的距离近，与遮阴处理(OJ.S.14d和OJ.S.7d)单独聚类。多年生黑麦草根际土壤的微生物基本都分布在第二、三象限，遮阴处理OJ.S.14d和OJ.S.7d单独聚类。这些结果表明遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构存在显著差异。

图1 PCoA分析遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落β多样性的影响

2.3 遮阴胁迫对两种草坪草根际土壤细菌群落组成的影响

在门水平上，共获得46个类群，其中11个门为优势类群(相对丰度> 1%)。麦冬根际土壤中的优势菌门有6个，分别为变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度为26.34%～35.23%；酸杆菌门(Acidobacteria)，相对丰度为19.79%～24.24%；奇古菌门(Thaumarchaeota)，相对丰度为8.95%～10.86%；浮霉菌门(Planctomycetes)，相对丰度为7.97%～9.22%；拟杆菌门(Bacteroidetes)，相对丰度为7.35%～9.40%；绿弯菌门(Chloroflexi)，相对丰度为3.71%～7.37%。多年生黑麦草中的优势菌也有6个，分别为酸杆菌门(Acidobacteria)，相对丰度为19.20%～32.96%；变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度为19.03%～24.49%；奇古菌门(Thaumarchaeota)，相对丰度为9.38%～11.06%；拟杆菌门(Bacteroidetes)，相对丰度为7.59%～10.49%；放线菌门(Actinobacteria)，相对丰度为4.04%～10.05%；浮霉菌门(Planctomycetes)，相对丰度为8.15%～8.72%。遮阴胁迫导致麦冬根际土壤中变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)的丰度明显增大，疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度明显降低(P<0.01)。然而，遮阴胁迫处理下多年生黑麦草根际土壤中疣微菌门(Verrucomicrobia)和酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度显著高于麦冬根际土壤(图2A)。

在属水平上，共鉴定25个类群。其中相对丰度高于0.5%的菌群有12个，分别属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、Spartobacteria菌纲(Spartobacteria)、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)和奇古菌纲(Thaumarchaeota)。麦冬根际土壤中的优势菌属分别为Candidatus_Nitrososphaera菌属(Candidatus_Nitrososphaera)(8.93%～10.86%)、硝化螺菌属(Nitrospira)(0.96%～2.92%)、Kaistobacter菌属(Kaistobacter)(0.98%～2.38%)、Steroidobacter菌属(Steroidobacter)(0.81%～2.02%)和黄杆菌属(Flavobacterium)(0.62%～0.85%)；而多年生黑麦草根际土壤中的优势菌属分别为Candidatus_Nitrososphaera菌属(Candidatus_Nitrososphaera)(9.38%～11.06%)、Kaistobacter菌属(Kaistobacter)(0.81%～1.47%)、Steroidobacter菌属(Steroidobacter)(0.34%～0.74%)和黄杆菌属(Flavobacterium)(0.42%～0.69%)。遮阴胁迫引起麦冬和多年生黑麦草根际土壤中硝化螺菌属(Nitrospira)、Steroidobacter菌属(Steroidobacter)、Kaistobacter菌属(Kaistobacter)和小梨形菌属(Pirellula)发生显著改变，这些菌属在麦冬根际土壤中呈现增加趋势，而在多年生黑麦草根际土壤中则表现为下降趋势(P< 0.01)。另外，遮阴胁迫下麦冬根际土壤中红游动菌属(Rhodoplanes)、浮霉菌属(Planctomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度显著高于多年生黑麦草，而在多年生黑麦草根际土壤中出芽菌属(Gemmata)具有较高相对丰度(P<0.001)(图2B)。

图2 遮阴对麦冬和多年生黑麦草根际土壤中细菌群落门水平(相对丰度>1%)(A)和属水平(0.5%)(B)的组成的影响

2.4 遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构与环境因子相关性分析

为了分析土壤理化因素对遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构的影响，对细菌群落组成与土壤理化性质进行Mantel相关性分析，结果如表3所示。在遮阴胁迫下，土壤中铵态氮、硝态氮、全钾是影响土壤中细菌群落结构的主要因素(P<0.05)。

表3 遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构与环境因子相关性分析

为进一步分析不同土壤理化性质对细菌群落结构的影响，对细菌群落结构与土壤理化性质进行典型相关分析(CCA)。研究结果显示，土壤速效钾和全氮是影响麦冬根际土壤细菌群落组成的主要因子。速效钾和全氮与麦冬根际土壤中芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿湾菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和WS3菌门正相关(P<0.05)(图3A)。

铵态氮、硝态氮和全氮是影响多年生黑麦草根际土壤细菌群落组成的主要环境因子。其中，铵态氮和全氮与放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和奇古菌门(Thaumarchaeota)正相关(P<0.05)，而硝态氮与疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和WS3菌门正相关(P<0.01)(图3B)。

3 讨论

根际土壤微生物对环境变化异常敏感，其种类和数量受土壤养分、植物和环境因子的共同影响[16]。遮阴胁迫引起光强、光质、空气和土壤温湿度等环境因子发生变化，进而影响草坪质量。

图3 典型相关分析遮阴胁迫下环境因子对麦冬(A)和多年生黑麦草(B)根际土壤细菌群落结构的影响

3.1 遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌多样性的影响

PCoA分析结果表明，麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落在第一主坐标轴上能明显区分开，说明两者之间的相似性很小，存在显著差异，这进一步说明植物本身对土壤细菌群落组成的影响强于遮阴胁迫处理。对根际土壤细菌群落丰富度和多样性研究发现，遮阴胁迫没有显著影响麦冬和多年生黑麦草根际土壤中细菌群落的丰富度和多样性，相似的结果在干旱和盐胁迫对土壤细菌群落的影响也有报道[17,18]。

3.2 遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌组成的影响

遮阴胁迫显著改变麦冬和多年生黑麦草根际土壤中细菌群落组成。在门水平上，麦冬根际土壤中相对丰度较高的为变形菌门和放线菌门。遮阴胁迫下，麦冬根际土壤中这些菌群呈现增加趋势，而在多年生黑麦草根际土壤中则表现为下降趋势。研究[19-22]发现，变形菌门和放线菌门的细菌能够提高植物干旱、盐、重金属等多种非生物胁迫抗性，这一结果可能与麦冬和多年生黑麦草本身的耐阴性差异有关。遮阴胁迫下，麦冬根际土壤中α-变形菌纲和γ-变形菌纲的菌群发挥重要作用，其中几个属包括Kaistobacter菌属(Kaistobacter)，Steroidobacter菌属(Steroidobacter)和假单胞菌属的相对丰度随着遮阴胁迫的延长表现为增加趋势，这可能与麦冬较强的耐阴能力有关。已有研究[23,24]报道，根际接种假单胞菌属植物生长促生菌能够有效地激活植物的多种代谢防御机制，从而提高植物的生物与非生胁迫抗性，本试验研究结果与其一致，遮阴胁迫下耐阴性强的麦冬根际土壤中假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度显著高于不耐阴的多年生黑麦草。

3.3 遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落组成与土壤理化性质相关性分析

为了进一步揭示遮阴影响麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落的影响，本试验分析了土壤理化性质与细菌群落组成的相关性。本研究发现，遮阴不同程度地改变麦冬和多年生黑麦草根际土壤的理化性质，进一步Mantel检验和CCA分析表明，土壤中铵态氮、硝态氮、全氮、速效钾与根际土壤中细菌群落组成相关性较大，其中，速效钾和全氮是改变麦冬根际土壤中芽单胞菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门和WS3相对丰度的主要因素，而全氮、铵态氮和硝态氮是影响多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构的主要因素，这可能是由于遮阴胁迫下麦冬和多年生黑麦草与土壤相互作用的反馈机制不同。相似的研究也表明铵态氮和总氮是影响胁迫下土壤细菌群落结构和多样性的主要环境因子[25,26]，这主要是由于铵态氮是细菌的主要氮源[27]。Chodak等[28]对土壤理化性质与土壤微生物群落相互作用的研究表明，土壤pH是导致干旱胁迫下土壤中变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门等细菌群落组成的主要因素。本试验研究结果与其不一致，可能是由于遮阴和干旱作为不同的非生物胁迫导致土壤理化性质改变差异加大所致，具体原因有待进一步探究。