ABA浸种对混合苏打盐碱胁迫下苜蓿种子萌发受阻的缓解作用

李 波，邬婷婷，李 红，杨 曌，林 浩

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种多年生豆科牧草，世界上广泛种植，具有产草量高、利用年限长、再生性强、适口性好、营养丰富等特点[1]，对改善土壤理化环境具有一定程度的作用。盐碱土作为一种土壤类型分布广泛，全世界的盐碱土地面积约有9.54×109hm2，分布于各大洲干旱地区，主要集中于欧亚大陆、非洲、美洲西部，我国的盐碱土地面积为9 913×104hm2，主要分布于东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带，土地盐碱化问题已经成为影响世界农业生产的最主要非生物胁迫之一，是影响区域经济发展和生态恢复的重要因素[2]。不同浓度的盐溶液对种子的萌发影响不同，同种盐分对不同牧草的种子萌发的影响也不尽相同。一般低盐浓度对苜蓿种子萌发均有促进作用，随盐处理浓度增高，发芽率一般呈下降趋势，不同浓度的盐胁迫下苜蓿种子的适应情况不同，同一苜蓿种子在萌发时对不同盐的适应情况也不同[3]。外源物质改善植物受到非生物胁迫的手段在现代农业中应用广泛，脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为一种胁迫激素，能够调节植物对胁迫环境的适应，提升植物对盐碱胁迫的耐受性，改善盐碱地上植物的生长[4-5]。本试验研究通过外施ABA，探讨不同浓度ABA溶液浸种对苏打盐碱胁迫下苜蓿种子萌发特性的影响，为解决苜蓿种子萌发的盐害问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以2种耐苏打盐碱性不同的紫花苜蓿品种的种子作为试验材料，分别为WL343HQ和龙牧807苜蓿(MedicagosativaL.cv. Longmu No.807)品种种子，均由黑龙江省畜牧研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1混合苏打盐碱胁迫苜蓿种子的发芽实验 挑选籽粒饱满2种苜蓿品种的种子各100粒，整齐摆放在平铺充分润湿的滤纸的发芽盒中，每个品种各处理重复3次。按照NaHCO3∶Na2CO3=9∶1的比例配制苏打盐碱溶液(1 mmol·L-1苏打盐碱含0.9 mmol·L-1NaHCO3和0.1 mmol·L-1Na2CO3)，倒入平铺有滤纸的发芽盒中，使滤纸充分润湿(约20 mL)。苏打盐碱胁迫浓度分别为20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1，对两种苜蓿种子进行不同浓度苏打盐碱胁迫，对照组则使用蒸馏水。摆放完毕后称重，记录重量以便每天通过补水维持胁迫溶液的种子的浓度。每天观察并记录发芽种子的个数。发芽盒置于HPG-280BX光照培养箱中进行培养，培养温度为25℃。7 d后随机选取各处理组10株芽苗测量每个芽苗的胚芽长、胚根长及10株芽苗的总鲜重，测量后的芽苗置于滤纸上阴干5 d，在80 ℃烘干箱烘干至恒重，测量芽苗干重。经7 d后分别选择两品种发芽率最接近50%的浓度组进行下一步试验。

1.2.2ABA处理苜蓿种子 配制不同浓度(25，50，75和100 μmol·L-1)的ABA溶液，对照组为蒸馏水，在避光条件下对2种苜蓿种子进行6 h浸种。浸种结束后，用蒸馏水将浸种的种子洗涤2次，洗涤过后，WL343HQ苜蓿种子使用浓度为40 mmol·L-1的苏打盐碱溶液进行胁迫，龙牧807苜蓿种子使用浓度为35 mmol·L-1的苏打盐碱溶液进行胁迫，培养条件和测定指标同1.2.1。

1.2.3测定指标 各指标测定公式[1]如下：

发芽率(%)= G7/N×100%；

发芽势(%)=G3/N×100%；

发芽指数(%)(GI)=ΣG7/D7×100%；

活力指数=GI×S。

其中G3表示3 d内的发芽数，G7表示7 d内的发芽数，Dt表示相应的发芽日数，N为种子总数，S表示平均主根长度(mm)。

胚根长(mm)：每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗胚根的平均值；

胚芽长(mm)：每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗胚芽的平均值；

鲜重(mg)：每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗的总重量；

干重(mg)：每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗烘干后的总重量；其中根长、芽长和鲜重于试验培养第7 d进行测定。

1.2.4数据处理与分析 数据用SPSS19.0和Excel软件进行统计分析，采用单因素方差分(ANOVA)和新复极差法(Duncan)比较同一品种的不同处理间的差异显著性，P<0.05时有统计学意义。数值为平均值±标准差。

数据标准化：

隶属度的计算[6]：对测得数据进行用模糊数学隶属度公式进行转换，隶属函数公式为：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 为第i个品种第j个胁迫浓度的k项指标的隶属度，Xmin、Xmax分别为k项指标的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 混合苏打盐碱胁迫对苜蓿种子发芽率的影响

不同浓度(20～60 mmol·L-1)混合苏打盐碱对两种苜蓿种子胁迫时发芽率变化见表1。在同一苏打盐碱胁迫浓度下，种子发芽率为WL343HQ>龙牧807。

两种苜蓿品种种子发芽率均随苏打盐碱浓度增加呈下降趋势，种子发芽率均低于对照组。35 mmol·L-1以下低苏打盐碱浓度对WL343HQ种子萌发抑制作用较小，高于40 mmol·L-1苏打盐碱浓度严重影响WL343HQ种子萌发，发芽率均低于60%；而龙牧807种子在苏打盐碱胁迫浓度为55和60 mmol·L-1时，种子的发芽率为0，说明此浓度下完全抑制了龙牧807苜蓿种子的萌发。30 mmol·L-1以下低苏打盐碱浓度对其种子萌发的抑制作用较小，高于35 mmol·L-1苏打盐碱浓度严重影响龙牧807种子萌发，除龙牧807在20 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度外，其它苏打盐碱浓度下两品种种子的发芽率均与对照差异显著(P<0.05)。

为确定两种苜蓿种子耐苏打盐碱适宜浓度，以种子发芽率作为苏打盐碱胁迫适宜浓度指标，对两种苜蓿种子发芽率进行线性回归，回归曲线和回归方程见图1，WL343HQ对苏打盐碱胁迫的半致死浓度为42.41 mmol·L-1，龙牧807的半致死浓度为36.61 mmol·L-1，确定WL343HQ和龙牧807后续试验苏打盐碱浓度分别采用40 mmol·L-1和35 mmol·L-1。

图1 苏打盐碱胁迫下2种苜蓿种子发芽率的变化

表1 苏打盐碱胁迫下苜蓿种子的发芽率

注：同列不同小写字母表示胁迫浓度间在0.05水平差异显著;“0” 代表在胁迫处理下种子未萌发，下同

Note:Different normal letters in line show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“0” indicates no germinate of seedings under stress treatment,the same as below

2.2 ABA对受混合苏打盐碱胁迫苜蓿种子萌发的影响

2.2.1发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数 经不同浓度的ABA缓解处理的受苏打盐碱胁迫的WL343HQ和龙牧807苜蓿种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均随ABA浓度的增加呈先升后降趋势，各指标均在ABA浓度为75 μmol·L-1时达到最高值(表2，表3)。在相同ABA浓度下，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均为WL343HQ>龙牧807。

WL343HQ发芽率在ABA浓度为50～100 μmol·L-1时均高于对照(ABA浓度0 μmol·L-1，盐碱浓度为40 mmol·L-1)，除25 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽率均与对照差异显著(P<0.05)；龙牧807发芽率在ABA处理浓度为75和100 μmol·L-1时高于对照(ABA浓度0 μmol·L-1，盐碱浓度为35 mmol·L-1)，除50和100 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽率均与对照差异显著(P<0.05)。WL343HQ发芽势在ABA浓度为25 μmol·L-1时低于对照，50～100 μmol·L-1时均高于对照，除50 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽势均与对照差异显著(P<0.05)；龙牧807仅在ABA浓度为75 μmol·L-1时高于对照，除50 和100 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽势均与对照差异显著(P<0.05)。

WL343HQ发芽指数在ABA浓度为75和100 μmol·L-1时高于对照，除50 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽势均与对照差异显著(P<0.05)；龙牧807发芽指数仅在ABA浓度为75 μmol·L-1时高于对照，除100 μmol·L-1ABA浓度外，其它ABA处理组发芽指数均与对照差异显著(P<0.05)。WL343HQ和龙牧807苜蓿种子的活力指数在各ABA浓度下均高于对照，两种苜蓿种子的活力指数除25 μmol·L-1ABA处理浓度外，其它ABA处理组活力指数均与对照差异显著(P<0.05)。

2.2.2胚芽长、胚根长、鲜重和干重 经不同浓度的ABA缓解处理的受苏打盐碱胁迫的WL343HQ和龙牧807芽苗的胚芽长、胚根长、鲜重和干重均随ABA浓度的增加呈先升后降趋势，均在75 μmol·L-1时达到最大值(表2，表3)。在相同ABA浓度下，胚芽长和胚根长均为WL343HQ<龙牧807(100 μmol·L-1ABA除外)，鲜重和干重均为WL343HQ>龙牧807。

WL343HQ和龙牧807胚芽长在各浓度ABA处理均高于对照，两种苜蓿芽苗的胚芽长在各浓度ABA处理组均与对照差异显著(P<0.05)，WL343HQ和龙牧807两种苜蓿芽苗的胚根长在各浓度ABA处理组均高于对照，两种苜蓿芽苗的胚根长在各浓度ABA处理组均与对照差异显著(P<0.05)。

WL343HQ和龙牧807两种苜蓿芽苗的鲜重在各浓度ABA处理下均高于对照，除25μmol·L-1ABA浓度的WL343HQ芽苗的鲜重外，两种苜蓿在各浓度ABA处理组均与对照差异显著(P<0.05)。WL343HQ苜蓿芽苗的干重在各浓度ABA处理下均高于对照，龙牧807芽苗的干重在ABA浓度50～100 μmol·L-1时高于对照，除25 μmol·L-1ABA浓度外，两种苜蓿芽苗的干重在各ABA处理组均与对照差异显著(P<0.05)。

表2 WL343HQ萌发指标

表3 龙牧807萌发指标

2.3 ABA对苜蓿种子萌发缓解效果综合分析

两种苜蓿种子在ABA缓解处理下种子萌发的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重和干重8项形态指标变化不同，应用单一指标不能准确反映ABA缓解作用。对不同ABA浓度处理下的两种苜蓿种子萌发的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重和干重的8项指标的变化进行隶属函数值计算，将各项隶属函数法累加进行综合分析(见表4)。WL343HQ和龙牧807苜蓿种子萌发在不同ABA浓度处理下的隶属值的排序均为：75 μmol·L-1>100 μmol·L-1>50 μmol·L-1>25 μmol·L-1>0 μmol·L-1，不同ABA浓度对苏打盐碱胁迫下的苜蓿种子萌发均产生一定的缓解作用，特别是ABA浓度为75 μmol·L-1时可对苏打盐碱胁迫下的苜蓿种子萌发有较好的缓解作用。

表4 ABA缓解苏打盐碱对2种苜蓿种子萌发及芽苗生长的隶属函数值

注：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW和DW分别代表发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重、干重

Note：GR,GP,GI,VI,EL,RL,FW and DW represent germination rate，germination potential,germination index,vitality index,embryo length,radical length,fresh weight,and dry weight

3 讨论

盐碱胁迫是影响生物生长的重要逆境因素之一，主要通过渗透作用与离子毒害作用对种子萌发产生抑制作用，而碱胁迫对种子萌发的抑制在盐胁迫的基础上，还包括较高的pH值作用，会使种子发生离子失衡，因此对植物种子的伤害作用更强[7-8]。Na2CO3和NaHCO3等碱性盐所造成的碱胁迫对植物的破坏作用明显大于由NaCl和Na2SO4等中性盐所造成的盐胁迫。Na2CO3和NaHCO3是内陆苏打盐碱土的主成分，生长在此类土壤上的植物受到Na+、低水势和高pH的多重胁迫[9-11]。本试验的研究结果发现，随着苏打盐碱浓度的增加，2种苜蓿种子发芽率降低，但在苏打盐碱浓度为20～35 mmol·L-1(WL343HQ)和20～30 mmol·L-1(龙牧807)时的每个处理浓度下的苜蓿种子的发芽状况均表现良好，体现了2种苜蓿种子具有一定的抗苏打盐碱能力，苏打盐碱浓度超过60 mmol·L-1时，2种苜蓿种子的很难萌发。这与蔺吉祥[12]等人研究盐碱胁迫对紫花苜蓿种子发芽的协同影响的结果一致。

ABA在植物体内是一种重要的生长调节激素，在植物受到胁迫时，ABA可缓解应激胁迫对植物带来的损害[13]。目前，在ABA缓解高温、低温、干旱、盐胁迫等方面均有研究。本研究利用不同浓度的ABA对苜蓿种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数及芽苗的胚芽长、胚根长、鲜重、干重指标进行测定，结果表明供试的外源激素浓度在75～100 μmol·L-1范围内对2种苜蓿种子的萌发和芽苗早期生长均有显著促进作用。通过试验研究发现，ABA可以有效缓解苏打盐碱胁迫带来的负效应，经过适宜浓度(75 μmol·L-1)的ABA处理的苜蓿种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数均较对照提高，也就是说ABA可以使苏打盐碱胁迫下的苜蓿种子出芽数增多，整齐度一致，生长活力提高。ABA的这种正效应是维持在一定浓度范围内的，可能是由于激素的正向调控作用存在一定的范围。

通常认为，ABA可诱导种子的休眠并抑制胚过早萌发，ABA对某些植物的种子萌发及幼苗生长发育具有一定的促进作用[14]。ABA作为胁迫激素还可提高植物对逆境的抵抗能力。研究中在一定苏打盐碱浓度下利用不同浓度ABA浸种处理2种苜蓿，能刺激苜蓿芽苗的胚芽、胚根部伸长和生物量积累，这显示ABA处理对苏打盐碱胁迫下幼苗生长具有一定的缓解作用，特别是在ABA浓度为75 μmol·L-1时对2种苜蓿苏打盐碱抑制作用有最大的缓解作用。这和彭浩等[15]研究脱落酸对盐胁迫下玉米种子萌发和幼苗生长的影响结果相似。该结果对苏打盐渍化土壤环境下苜蓿牧场建植有一定的参考作用，应用于生产实践或者其他牧草是否有明显的缓解效果有待于进一步验证。

4 结论

2种苜蓿种子受苏打盐碱胁迫作用降低其种子的发芽率，WL343HQ和龙牧807苜蓿种子对苏打盐碱胁迫的半致死浓度分别为40 mmol·L-1和35 mmol·L-1；ABA作为胁迫因素对2种苜蓿苏打盐碱胁迫的种子萌发和芽苗生长均有促进效应，ABA浸种可有效提高苏打盐碱胁迫下苜蓿种子的萌发能力，随着ABA处理浓度的增加，苜蓿在苏打盐碱胁迫下的种子萌发能力逐渐提高，其中以75 μmol·L-1处理效果最好，超过75 μmol·L-1后苜蓿种子的萌发能力和芽苗生长效果降低。ABA浓度为75 μmol·L-1时，可最大程度的缓解苏打盐碱对2种苜蓿种子萌发的抑制作用。