山药-梨复合型果醋发酵工艺

张海玲，程倩倩，尹新雅，朱桂兰，王淑华

(合肥师范学院，安徽 合肥，230000)

果醋是以水果或果品加工下脚料为主要原料加工而成的酸性调味品[1-3]，具有提高肝脏的解毒功能，改善新陈代谢，降低血压，维持体内酸碱平衡，开胃消食，预防结石和便秘，美容护肤，助睡眠等功效[4-6]。研究发现，醋中含有的多酚物质可以清除自由基，如丹宁酸等可保护肠道不受过氧化物的损害，维持肠道的菌群平衡[7-8]。果醋具有水果和食醋的营养保健功能，是集营养、保健、食疗等功能为一体的新型保健饮品。

安徽省砀山县为主要酥梨产区，是我国果品中的名产[9-10]。砀山梨中含有10%～17%的糖分(葡萄糖、果糖、蔗糖等)、0.01%～0.03%的有机酸(苹果酸、柠檬酸、琥珀酸)、矿物质(钙、磷、硒)也和多种维生素(维生素C、维生素A、维生素E)等含量相对较丰富，具备解肺热、止咳、清心和消痰润肺等生理功能[11]。山药具备丰富的营养价值，含黄酮、多糖等多种活性保健成分，具备聪耳明目、补肺健脾等重要益处[12]。本文以淮山山药和砀山梨为原料，对生产的关键技术进行研究，加工制成复合型果醋，为解决砀山梨和山药的储藏与运输问题提高一种新思路，同时开发出一款口味独特、健康美味的新产品提高理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

砀山梨，安徽砀山产；山药，淮南山药；安琪高活性酵母，安琪酵母股份有限公司；醋酸菌，上海佳民酿造食品有限公司；果胶酶，山东一品食品配料有限公司；柠檬酸，山东中创柠檬酸生化有限公司；壳聚糖，山东旭东生物科技有限公司。柠檬、食盐、白砂糖等辅料均为食品级。

1.2 仪器与设备

JYL-D57 榨汁机，九阳股份有限公司；DNP-9162IA型电热恒温培养箱、ZHP-Y2102F智能恒温振荡培养箱，上海三发科学仪器有限公司；WAY-2W阿贝折光仪，上海精科物光有限公司；FA2204分析天平，上海仪电分析仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；PHS-25 pH计，深圳市三泰衡器有限公司。

2 实验方法

2.1 工艺流程

梨→去核，去皮洗净→护色

↓

山药→去皮洗净→切片→护色→预煮→榨汁→滤汁混匀→澄清→成分调整→杀菌→酒精发酵→醋酸发酵→澄清→过滤→灭菌→成品

2.2 操作要点

护色：将10 g食盐和3 g柠檬酸溶于500 mL的蒸馏水中，将上述处理好的山药和梨加入配制好的护色液中，护色5 min[13-14]。

澄清：将果胶酶加入混匀后的山药-梨汁中，添加量是山药-梨汁总体积的7.5%[15-16]，加入果胶酶后继续混匀。

酸度调整：利用新鲜的柠檬汁调整山药-梨汁的pH，使其维持在4左右。

杀菌：在调整好成分的山药-梨汁中以80 mg/L加入焦亚硫酸钾[17]。

酒精发酵：称取0.1 ～0.5 g/L活性干酵母添加到10倍质量浓度为5%蔗糖水中，于38～39 ℃的恒温水浴锅中活化20 min，摇匀后，再添加到上述山药-梨汁中；加入活化酵母菌后，将上述山药-梨汁依次放置在温度为20～35 ℃的恒温培养箱，发酵4～10 d[17]。

醋酸发酵：以山药-梨果酒为培养基，放在30 ℃的恒温水浴锅中并不停搅拌，直至大部分醋酸菌溶解。放置于25～40 ℃的恒温摇床培养箱，以120 r/min的转速分别发酵4～10 d。

澄清：用质量浓度为1%壳聚糖对山药-梨醋进行澄清。用量为果醋总质量的0.5%[18-20]，静置1.5 h。

杀菌：将澄清后的山药-梨复合醋在82 ℃的条件下水浴20 min，水浴后快速冷却到4～5 ℃，即得到山药-梨复合醋成品。

2.3 山药-梨汁最佳配比的确定

依次将山药汁与梨汁配比为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(v/v)的山药-梨汁按照上述要求混合均匀后，再在25 ℃的酒精发酵温度，0.2 g/L的酵母接种量，山药-梨汁的初始糖为100 g/L，4 d的发酵时间的固定酒精发酵条件下和0.1 g/L的醋酸接种量，发酵温度为25 ℃，发酵6 d，通过感官评价指标确定山药汁与梨汁的最佳配比。

2.4 山药-梨醋酒精发酵工艺的确定

2.4.1 山药-梨醋酒精发酵单因素试验

初始糖度的确定：按照要求将山药-梨汁的初始糖度分别调整到50、100、150、200、250 g/L，将不同初始糖度的山药-梨汁进行成分调整、杀菌，然后在25 ℃，发酵4 d,0.2 g/L的酵母添加量，测定山药-梨酒中酒精度值和残余糖度，以探究不同初始糖度对酒精发酵的影响。

酵母添加量的确定：依次在山药-梨汁中添加100、200、300、400、500 mg/L的活化好的酵母，在山药-梨汁初始糖度为100 g/L、发酵温度为25 ℃的恒定发酵条件下发酵4 d，测定山药-梨酒中残余糖度和酒精度。

酒精发酵温度的确定:将山药-梨汁的糖度调整到100 g/L后，以200 mg/L的酵母接种量分别在20、25、30、35 ℃下发酵4 d，测定山药-梨酒的残余糖度和酒精度。

酒精发酵时间的确定：将山药-梨汁的糖度调整为100 g/L，在0.2 g/L的酵母添加量，发酵温度为25 ℃的恒定条件下分别发酵4、6、8、10 d，测定在山药-梨酒的残余糖度和酒精度。

2.4.2 山药-梨醋酒精发酵正交实验

根据单因素实验的结果确定的各因素最佳水平的上下范围浮动一定值，选取3个水平，进行4因素3水平正交实验，以产品酒精度为评价指标，确定最优的酒精发酵条件参数。

表1 酒精发酵参数优化正交实验因素与水平设计表Table 1 Coded values and corresponding actual of the optimization parameters tested in orthogonal array design

2.5 山药-梨醋醋酸发酵最佳工艺的确定

2.5.1 山药-梨醋醋酸发酵单因素实验

醋酸添加量的确定：分别在山药-梨酒中添加0.1、0.2、0.3、0.4 g/L的醋酸菌，并放置于30 ℃的恒温水浴锅中不停搅拌，直至大部分醋酸菌溶解。再将其放置于发酵温度为30 ℃的智能恒温振荡培养箱中发酵6 d，测量在不同醋酸菌添加量下山药-梨果醋的总酸含量(以乙酸计，g/kg)，以探究不同醋酸添加量对醋酸发酵的影响。

醋酸发酵温度的确定：向山药-梨酒中以0.2 g/L的添加量加入醋酸菌，并放在30 ℃的恒温水浴锅中不停搅拌，直至大部分醋酸菌溶解。再放置于温度为25、30、35、40 ℃的智能恒温振荡培养箱中发酵6 d。检测在不同醋酸菌添加量下山药-梨果醋的总酸含量(以乙酸计，g/kg)，以探究不同发酵温度对醋酸发酵的影响。

醋酸发酵时间的确定：向山药-梨果酒中以0.2 g/L的添加量添加醋酸菌，并放置于30 ℃的恒温水浴锅中不停搅拌，直至大部分醋酸菌溶解。在发酵温度为30 ℃下发酵4、6、8、10 d。测定在不同发酵时间条件下发酵而成的山药-梨果醋中的总酸含量(以乙酸计，g/kg)，以探究不同发酵时间对醋酸发酵的影响。

2.5.2 山药-梨醋醋酸发酵正交实验

根据单因素实验结果，醋酸添加量、发酵温度、醋酸发酵时间是影响果醋醋酸发酵工艺的主要因素，故以此3因素进行正交试验，以产品乙酸含量确定出最优的醋酸发酵条件参数。

表2 醋酸发酵参数优化正交试验因素与水平设计表Table 2 Coded values and corresponding actual of the optimization parameters tested in orthogonal array design

2.6 产品分析检测方法

2.6.1 感官评价

取50 mL混合均匀的山药-梨醋于洁净的发酵瓶中，在光亮处目测其色泽、组织状态和杂质，嗅其气味，品尝其滋味。参照国标“GB/T 18187—2000 酿造食醋”[21]中感官指标要求，果醋的感官评价主要从色泽、滋味和气味、组织状态和杂质4个方面进行，要求为果醋澄清透明，无悬浮物及沉淀物，色泽为淡棕色或琥珀色，醋味柔和，略带甜味，具有浓郁的醋香、酯香和水果固有的清淡芳香，且果香、醋香浓郁协调,无其他异味。

2.6.2 理化指标及微生物检测方法

(1)糖度的测定采用阿贝折光仪测定;

(2)酒精度的测量：酒精计法[22]；

(3)总酸的测定：利用GB/T 12456—2008标准[23]中碱式滴定管(酸碱滴定法)对制得的果醋产品进行总酸(以乙酸计，g/kg)检测；

(4)微生物检测：利用GB 4789.3—2016标准MPN法[24]对制得的果醋进行大肠菌群的检测。

3 结果与分析

3.1 山药-梨汁最佳配比

表3是由不同配料比混合均匀的山药-梨汁在固定的酒精发酵条件和醋酸发酵条件下发酵而成的果醋的感官评价的具体情况。

表3 山药-梨汁最佳配比的感官评价Table 3 Sensory evaluation of the optimal ratio of yam-pear juice

由表3可知，当山药汁与梨汁的配比为1∶3(v/v)时，色泽和组织状态最符合感官要求，为最佳配比。

3.2 山药-梨醋酒精发酵最佳工艺的确定

3.2.1 初始糖度对果醋酒精发酵的影响

由图1可知，当初始糖度低于150 g/L时，山药-梨汁的初始糖度越高，山药-梨汁中的糖转化成酒精的糖含量也越多，因此酒精度逐渐上升。初始糖度高于150 g/L的时候，由于本次发酵酵母菌接种量为2 g/L，发酵能力有限，山药-梨汁中多余的糖无法转化成酒精，酒精度值不再增加，且测得当初始糖度为15 g/L发酵所得的酒精度为9.5% vol。醋酸菌对酒精耐受能力有限，酒精体积分数超过10%时会逐渐抑制醋酸菌的生长[25]，钝化其氧化酒精能力，而且在较高的酒精含量条件下，乙醛脱氢酶稳定性较差，造成了乙醛的积累[26]。因此，酒精发酵的初始糖度为150 g/L较合适。

图1 初始糖度对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation

3.2.2 酵母添加量对酒精发酵的影响

图2 酵母添加量对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of yeast addition on alcohol fermentation

从图2可以看出，酵母菌添加量低于0.3 g/L时，酵母菌全部被还原糖利用，转变成乙醇，所以由糖转化为酒精的含量随着酵母添加量的增加越来越多。然而，山药-梨汁中的糖有限，因此当酵母菌接种量高于0.3 g/L时，山药-梨酒中的酒精度不会再增加。所以，酵母菌添加量为0.3 g/L最有利于山药-梨醋的酒精发酵阶段。

3.2.3 发酵温度对酒精发酵的影响

从图3可以看出，发酵温度低于30 ℃时，发酵温度处于酵母的生长温度范围内，酵母菌的活力随着温度的升高而曾强，即随着酒精发酵温度的升高，山药-梨酒中乙醇含量越来越高。但当发酵温度高于30 ℃时，由于温度过高抑制甚至破坏了酵母的活性，山药-梨汁中的糖转化为酒精的比例减少，即酒精含量减少。因此，发酵温度为30 ℃最有利于山药-梨醋的酒精发酵阶段。

图3 发酵温度对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation

3.2.4 发酵时间对酒精发酵的影响

从图4可看出，山药-梨汁中糖慢慢转变为乙醇。当酒精发酵时间低于8 d时，发酵时间越长，山药-梨汁中的酒精越多，山药-梨汁发酵成山药-梨果酒。然而山药-梨汁中的糖含量有限，当发酵时间到达一定时间后，即发酵时间大于8 d时，山药-梨果酒的酒精含量不会发生变化。故8 d的发酵时间最有利于山药-梨醋的酒精发酵。

图4 发酵时间对酒精发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol fermentation

3.2.5 酒精发酵参数正交实验

从表4可以看出，山药-梨醋的酒精发酵阶段的各因素影响大小为：发酵时间(D)=发酵温度(C)>初始糖度(A)>酵母菌添加量(B)。酒精发酵的最优组合为C1D2A2B2，即发酵温度28 ℃，发酵时间8 d，初始糖度质量浓度150 g/L，酵母菌添加量0.3 g/L。在最优组合条件下发酵的山药-梨复合醋的酒精含量为18.5% vol，在上述的组合条件中酒精度最高。

表4 酒精发酵参数优化正交实验结果Table 4 Orthogonal array design matrix and results of alcohol fermentation

3.3 山药-梨醋醋酸发酵最佳工艺的确定

3.3.1 醋酸菌添加量对醋酸发酵的影响

从图5可以看出，醋酸添加量低于0.3 g/L时，随着醋酸菌添加量的增加，山药-梨酒中越来越多的酒精转化成醋酸，山药-梨酒逐渐转化为山药-梨醋，因此总酸含量随着醋酸菌添加量的增加而增加。但是，山药-梨酒中酒精含量有限，当醋酸接种量高于0.3 g/L时，总酸含量不变。所以，醋酸菌接种量为0.3 g/L时最有利于山药-梨复合醋的醋酸发酵阶段。

图5 醋酸菌添加量对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of acetic acid bacteria addition on acetic acid fermentation

3.3.2 发酵温度对醋酸发酵的影响

从图6可以看出，发酵温度低于35 ℃时，果醋中的总酸含量随着发酵温度的升高越来越多。但是，当发酵温度高于35 ℃时，由于发酵温度过高破坏了醋酸菌的活性，抑制甚至破坏乙醇转化为乙酸，使果醋中总酸含量减少。因此，发酵温度为35 ℃最有利于山药-梨醋的醋酸发酵阶段。

图6 发酵温度对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

3.3.3 发酵时间对醋酸发酵的影响

从图7可以得知，当发酵时间为4 d时，由于醋酸发酵时间过短，山药-梨复合醋中只有一小部分酒精转化成乙酸，随着发酵时间的增加，山药-梨复合醋中越来越多的酒精转化成醋酸。4～8 d时醋酸菌的发酵力旺盛，产酸量迅速增加，10 d后果醋产酸速度明显下降，此时的产酸量为5.43 g/kg，达到“GB/T 30884—2014 苹果醋饮料”[27]中对果醋中总酸含量不低于3 g/kg的要求，并结合从第10天起发酵速度明显降低的情况，选择发酵时间为10 d最有利于山药-梨醋的醋酸发酵的时间。

图7 发酵时间对醋酸发酵的影响Fig.7 Effect of fermentation time on acetic acid fermentation

3.3.4 醋酸发酵参数正交实验

从表5中可得，醋酸发酵阶段各因素的影响大小按顺序排列是：发酵时间(C)、发酵温度(B)、醋酸菌添加量(A)。醋酸发酵的最佳组合是A2B1C3即最佳的醋酸发酵条件参数是发酵时间11 d，发酵温度32 ℃，醋酸菌接种量0.3 g/L。由最优组合条件发酵的果醋总酸含量是7.12 g/kg，并对此组果醋进行感官评定，发现该结果醋具有浓郁的醋香和水果固有的清淡芳香，果香、醋香浓郁协调，酸甜适口。在由上述所有的组合条件中制得的果醋中总酸含量最高。

表5 醋酸发酵参数优化正交实验结果表Table 5 Orthogonal array design matrix and results of acetic acid fermentation

3.4 产品质量指标分析

3.4.1 感官指标

对山药梨复合果醋进行感官评价，结果见表6。以山药和砀山梨为原料采用最佳醋酸发酵工艺酿制而成的复合果醋产品色泽淡黄，有光泽，酸味柔和，口感上佳，体态透明清澈无沉淀，具有特有梨和山药的果香和醋香。该山药梨复合果醋感官指标符合“ GB 18187—2000酿造食醋”[21]要求。

表6 山药梨复合果醋的感官评价表Table 6 Sensory evaluation of compound yam-pear vinegar

3.4.2 理化指标

测得所得山药梨复合果醋的总酸含量为7.12 g/kg，符合“GB/T 30884—2014 苹果醋饮料”[25]对总酸的要求。

表7 山药梨复合果醋的理化指标Table 7 Physicochemical indexes of compound yam-pear vinegar

3.4.3 微生物指标

依据GB/T 4789.2—2018“食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数”对菌群总数进行测定，该品中含菌落总数为5 CFU/mL；依据GB 4789.3—2018中平板计数法对大肠菌群进行检验，该产品中大肠菌群计数为0 MPN/100 mL，因此大肠菌群的检测结果为阴性；且无致病菌检出。微生物指标均符合“GB/T 2719—2003 食醋卫生标准”[28]和2019年12月21日即将要实施的“GB/T 2719—2018食品安全国家标准食醋”[29]中的要求，见表8。

表8 山药梨复合果醋的微生物指标Table 8 Microbial indicators of compound yam-pear vinegar

4 结论

本实验以砀山梨和淮山药为原料，对果醋的发酵工艺进行研究和优化。山药-梨复合醋最优的原料配比为1∶3。控制初始糖质量浓度为150 g/L，酵母添加量为0.3 g/L，于28 ℃下酒精发酵8 d；在此条件下进行醋酸发酵，控制醋酸菌添加量为0.3 g/L，在32 ℃下发酵11 d，成品中的乙酸含量达到7.12 g/kg。所制得山药-梨复合果醋的感官、理化和微生物指标均符合国家标准，具有独特风味。