中高温大曲曲块部位间生化指标的差异及变化规律

杨勇，李燕荣，姜雷，贾亚伟，王启彪

(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏 宿迁，223800)

“曲是酒之骨”，大曲在浓香型白酒生产中起着至关重要的作用[1]。大曲作为一种富含多酶多菌的微生态制品，具有糖化、发酵、生香等功能，是传统固态发酵蒸馏大曲酒的重要物质保障[2]，其品质好坏直接决定了酒的风格及档次。作为块状曲，不同曲块部位因通气性、水分、温度等微环境的差异而呈现不同的质量[3]。

本文选取中高温大曲为研究对象，将块状曲细分为曲皮、曲心及火圈，研究曲块部位间生化性能的差异，结合在培菌发酵过程中变化规律和相关性的研究，进一步剖析大曲的生化功能，为制曲工艺的调整、优化甚至现代化提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

大曲样品：中高温大曲，选择7月上旬入房发酵的四房曲进行跟踪研究。

HCl，NaOH，H2SO4，可溶性淀粉，CuSO4，酒石酸钾钠，亚铁氰化钾，醋酸，醋酸钠，三氯乙酸，乳酸钠，Na2CO3，酪素，乙醇，己酸，正庚烷等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、控温水浴锅、干燥箱、分光光度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 取样

1.3.1.1 成品曲曲块部位间取样

将成品大曲拆分为曲皮、火圈与曲心，分3批次，每批次取3房，每房10块曲粉碎混匀作为1个样本，每个部位9个样本，取平均值。

1.3.1.2 大曲发酵过程取样

对发酵期全流程进行跟踪并取样。取样时间分别为主发酵期(1、2、3 d)、潮火期(4、5、6、7 d)、大火期(8、9、10、11、13、15 d)、后火期(17、19 d)、养曲期(22、25、29、32、36 d)。采用五点取样法，将曲样分为曲皮样和曲心样，并依据软硬情况，用粉碎机进行粉碎，过40目筛备用。

1.3.2 检测方法[4]

水分测定：采用快速烘干法，130 ℃ 烘1 h；利用酸、碱中和法测定酸度，以10 g曲消耗0.1 mol/L的NaOH溶液的毫升数表示，单位mmol/10 g曲；淀粉测定采用1∶4的HCl进行加热回流水解，用斐林试剂测定生成的糖；糖化力测定：采用斐林溶液滴定法测量，即1 g干曲在35 ℃、pH 4.6条件下反应1 h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖的毫克数(U/g)；发酵力测定：1 g曲样在25 ℃糖化液中发酵48 h失重的质量分数(g/10 g)；酯化力测定：0.8 g绝干曲在乙醇庚烷和己酸庚烷溶液中30 ℃条件下反应72 h，用NaOH滴定未消耗的己酸；酸性蛋白酶活力测定：1 g曲在一定的温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活单位，以U/g表示。

1.4 数据处理

结果采用平均值±标准偏差表示。数据采用SPSS 21.0软件和Excel进行统计分析、绘图和相关性分析，显著性水平设定在5%。

2 结果与分析

2.1 中高温成品大曲不同部位间生化指标的差异

由表1可知，大曲不同部位的理化、酶系及菌数都呈现显著性差异。就理化特征而言，曲皮中的水分和酸度最小，其次是曲心，火圈最大；而淀粉在大曲不同部位中的含量差异则相反，曲皮略高于曲心。就酶活而言，曲皮的糖化力、发酵力最高，其次是火圈，曲心最低；酯化力则相反，曲皮最低，火圈次之，曲心最高；酸性蛋白酶活力则是曲皮远大于火圈和曲心，曲心略高于火圈。就菌数而言，曲皮中的细菌、霉菌和酵母数量都远高于其他部位，占绝对优势，曲心中的细菌最低，火圈中的霉菌数量则是最低的。

表1 成品大曲曲块部位间生化指标的差异Table 1 Difference of biochemical indexes between parts of finished daqu

不同字母表示同行具有显著性差异。

2.2 中高温大曲部位间生化指标在发酵期的变化规律

2.2.1 曲心温度变化规律

通过跟踪大曲在培菌发酵过程中的曲心温度，取平均值，结果如图1所示。大曲发酵整体表现为前缓中挺后缓落，第8天顶火，占火8 d左右，后缓慢落火至48 ℃，此后进入养曲期。就各阶段而言：当前季节，大曲培菌发酵在第4天并房，并房温度48 ℃，并房过程中温度稍有降低；第7天上架，上架温度56 ℃左右；第8天达到顶火温度，顶火温度最高可达到60 ℃以上；占火8 d后进入后火期，第20天落至48 ℃；而后进入养曲期，养曲15 d后出房入库贮存。

图1 培菌发酵期曲心温度的变化Fig.1 Temperature variation of Daqu during fermentation

2.2.2 水分变化规律

微生物的生长离不开水分，水的比热高，能够吸收微生物生长代谢过程中释放的热量，具有调节大曲品温的功能[5]。由图2可知,入房时，大曲水分在38%左右；发酵前10 d，曲块表面水分、氧气都很充足，好氧性微生物霉菌和酵母大量繁殖，曲温也逐渐上升，结合翻曲与放门排潮等工艺操作，曲皮水分迅速减少，在第10天即大火第3天后就基本散失殆尽，低至12%左右；曲心水分则在发酵初期变化不大，当曲块温度逐渐升高至大火期，曲皮水分散失严重，不能满足微生物的繁殖所需，而此时曲心水分充足，曲心处“高湿”、“微氧”的环境极其有利于微生物的生长[6]，迫使微生物由曲皮转向曲心内部生长繁殖，曲心水分借助大曲穿衣过程中霉菌菌丝渗透形成的微孔通道外排，发酵10 d后呈递减趋势，出房时达到13%左右。在整个培菌发酵过程中，曲心的水分始终高于曲皮，水分是由外到里逐渐散失。

图2 大曲培养过程中不同部位的水分变化Fig.2 Variation of water content in different parts of Daqu during culture

2.2.3 酸度变化规律

大曲酸度主要由两方面形成，一方面是由于生酸微生物代谢形成的有机酸，另一方面来源于微生物通过三羧酸循环降解蛋白质、脂肪和淀粉而形成的各种酸类物质[5]。由图3可知，大曲的制曲前期因代谢旺盛，发酵第4天出现一个产酸高峰，曲心酸度高达2.3 mmol/10 g曲左右，曲皮酸度则升至1.3 mmol/10 g曲左右；酸度的大小与微生物数量变化有很密切的关系，尤其与芽孢杆菌数量变化成正相关[7]；放门排潮后，曲皮酸度降至与入房时相当，曲心酸度则维持高位平缓态势；进入大火期后，不耐热的微生物大量死亡，曲心酸度也迅速递减，曲皮酸度则先略降后又略升；下柴后，部分耐高温芽孢杆菌开始生长繁殖，曲皮与曲心酸度小幅上升，伴随着曲皮与曲心水分散失殆尽，微生物无法生存，曲皮与曲心酸度又缓落直至发酵结束。

图3 大曲培养过程中不同部位的酸度变化Fig.3 Variation of acidity in different parts of Daqu during culture

2.2.4 淀粉变化规律

大曲的淀粉为微生物的生长繁殖提供了营养和前体物质基础，是大曲重要指标之一。制曲发酵过程中的淀粉含量(折算为12%水分条件下)变化情况如图4所示。入房时，大曲淀粉含量为64%左右；发酵初期，微生物大量生长与繁殖，淀粉被快速消耗利用，曲皮与曲心淀粉含量均呈递减趋势；直至进入大火后，60 ℃左右的高温使曲皮与曲心的微生物大量死亡，仅存能够耐高温的芽孢杆菌，因此，淀粉消耗很少而保持平缓趋势直至发酵结束。整个发酵过程中，曲心淀粉含量始终略高于曲皮，这也与曲心微生物远低于曲皮相对应。

图4 大曲培养过程中不同部位的淀粉变化Fig.4 Variation of starch in different parts of Daqu during culture

2.2.5 糖化力变化规律

糖化力是糖化型淀粉酶将淀粉糖化生成葡萄糖的过程[5]。其活力的高低直接关系到酿酒过程中淀粉的转化率。由图5可知，入房时，大曲糖化力高达760 mg葡萄糖/(g曲·h)，这主要是因为大曲是生料发酵，原料中小麦自身就含有一定的糖化酶；但原料自身糖化力易受温度影响，极不稳定；主发酵期，曲温逐步上升，与糖化力相关的好氧性微生物霉菌在曲皮大量繁殖，原料自身携带的糖化力虽快速降低，但霉菌代谢生成的糖化酶则快速增长，导致曲皮的整体糖化力基本无变化，但曲心中霉菌很少，糖化力在入房2 d后即快速下降至30 mg葡萄糖/(g曲·h)左右；放门排潮后，曲温进一步上升，曲皮水分进一步降低，霉菌代谢受到抑制，细菌开始占据主导优势，糖化力快速下降直至入房时的一半，曲心糖化力维持低位；进入大火与后火期，微生物大量死亡，曲皮糖化力先缓升后缓降，变化幅度不大，曲心糖化力仍无变化；养曲期，随着曲温逐渐降到室温，曲心部分尚有余水，少数耐干燥的红曲霉菌等微生物尚能发育，曲皮糖化力开始回升并呈波动式变化，曲心糖化力也缓慢升高；出房时，曲皮糖化力为600 mg葡萄糖/g(曲·h)左右，曲心约为150 mg葡萄糖/(g曲·h)。就整个培菌发酵过程而言，结合成品曲不同部位的糖化力，不难发现大曲糖化力主要来自于曲皮。

图5 大曲培养过程中不同部位的糖化力变化Fig.5 Variation of saccharifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.6 发酵力变化规律

发酵力是大曲中的酶发酵糖产生CO2和生成酒精的过程强弱的评价，其变化主要是与酵母菌关系密切[5]。由图6可知,在整个发酵过程中，曲皮与曲心发酵力的变化趋势基本相同。发酵初始，大曲即具有高达12 g CO2/(10 g曲·48 h)的发酵力，这与酿酒区域存在大量野生酵母息息相关；发酵初期，曲块温度适宜，水分、氧气充足，好氧微生物酵母大量增殖，在曲心中占绝对优势，曲皮中也大量繁殖，发酵力快速上升至最高峰，即22 g CO2/(10 g曲·48 h)左右；放门排潮后，随着曲块温度的进一步升高和水分的流失，酵母增殖受阻，因此发酵力快速下降；之后的环境条件更加苛刻，营养物质的转移和补充也较困难，酵母已处于难以生长的境地，死亡速度与繁殖速度相比时高时低，曲皮与曲心的发酵力呈波浪式缓升缓降，变化不大；发酵15 d后，曲块落火，曲皮较曲心温度低，导致酵母在曲皮中的数量高于曲心，发酵力也略高于曲心，这也与成品曲中曲皮酵母数量和发酵力显著高于曲心一致。

图6 大曲培养过程中不同部位的发酵力变化Fig.6 Variation of fermenting power in different parts of Daqu during culture

2.2.7 酯化力变化规律

酯化力是大曲自身经发酵后固有的催化生酯的能力。由图7可知，在培菌发酵过程中，曲皮与曲心的变化趋势基本相同，前期波动幅度较大，而后呈缓升缓降后平稳的趋势；发酵初期，微生物在低温高水分的条件下极易生长，入房后各类微生物便开始发育，在曲柸上大量生长繁殖，此时主要进行数量增殖；在潮火中后期，各类微生物数量达到极限，开始启动代谢酯化酶，酯化力快速上升，发酵第8天达到峰值；此时，曲块已达到顶火温度，不耐热微生物大量死亡，霉菌和酵母的代谢受到抑制，酯化酶活力迅速降至谷底，发酵第10天后保持平缓；落火后，由于曲皮部分含水低，微生物很难生长，但曲心部分含水稍高，少数耐干燥的红曲霉菌等微生物尚能发育，代谢生成酯化酶，曲心酯化力有所回升；养曲期间，曲心水分进一步散失，微生物生存条件更加恶劣，酯化酶活力缓慢下降，出房时酯化力在10%左右。

图7 大曲培养过程中不同部位的酯化力变化Fig.7 Variation of esterifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.8 酸性蛋白酶活力变化规律

酸性蛋白酶能在低pH条件下有效水解蛋白质，在白酒发酵过程中起协同作用，溶解发酵原料的颗粒，促进微生物繁殖，分解蛋白质生成香味物质，分解酵母菌体蛋白，但活力过高却会阻碍生料发酵，使酒焦苦味重。由图8可知，在培菌发酵过程中，曲皮与曲心的酸性蛋白酶活力变化趋势基本相同，潮火期开始迅速增长，大火期开始迅速下降，后期呈平缓趋势；发酵初期，各种微生物可以吸收原料中自带的氨基酸进行生长繁殖；进入潮火期后，随着微生物的进一步生长繁殖和原料自带氨基酸的消耗，微生物靠自身代谢产生蛋白酶分解产生大量氨基酸来满足微生物的增殖需求；随着大曲进入高温发酵期，微生物数量锐减，氨基酸也参与美拉德反应生成曲香风味物质，加上蛋白酶耐热性较差，酸性蛋白酶活力迅速下降；后期随着大曲水分的进一步散失，微生物生长环境进一步恶化，蛋白酶活力基本呈平缓趋势。

图8 大曲培养过程中不同部位的酸性蛋白酶活力变化Fig.8 Variation of acid protease activity in different parts of Daqu during culture

2.2.9 微生物区系变化规律

大曲的生产是开放式的，微生物来源十分广泛，包括原料、环境、工具、操作等，群落十分复杂。根据微生物的形态和生理特性，主要包括细菌、霉菌与酵母菌[8]。由图9可知，入房时以细菌为主导，由外源带入；主发酵期，酵母大量增殖，在曲心中占绝对优势，曲皮中也大量繁殖，霉菌在主发酵后期开始大量增殖；潮火期，随着温度的进一步上升，曲心中细菌开始占优势，主要是产酸细菌，曲皮则是由细菌和霉菌共同主导，因此，潮火期是霉菌大量繁殖的重要时期；进入大火期后，曲皮与曲心都是细菌占绝对优势，以耐热的芽孢杆菌为主，曲皮中仍有少量霉菌以孢子形式存在；落火及养曲期间，经过高温驯化，曲皮与曲心中仍然是细菌占绝对优势，霉菌与酵母很少。

图9 大曲培养过程中曲皮与曲心微生物数量占比Fig.9 Variation of microbial number proportion between curved skin and inside of Daqu

2.3 相关性分析

大曲发酵过程中，生化指标之间具有一定的相关性，且曲皮与曲心之间也有一定的差异性。如表2所示,糖化力与淀粉、细菌数量以及曲皮的水分和曲心的酵母之间都呈显著正相关，发酵力与水分、淀粉、酵母以及曲皮细菌数量显著正相关，发酵力、曲皮糖化力都与曲心温度呈显著负相关，说明随着淀粉的消耗、曲皮水分的散失和曲心温度的升高，糖化力和发酵力总体呈下降趋势，进而影响细菌和酵母数量的增殖，同时说明发酵力主要由酵母提供，与传统理论一致；酯化力、酸性蛋白酶活力则与水分和淀粉之间相关性不大，说明其还与其他因素相关，如温度、酸度等，表2显示曲皮和曲心的酸性蛋白酶都与曲心温度呈显著正相关，曲心中的酸性蛋白酶还与酸度呈显著正相关，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力显著正相关，说明曲心温度的升高和产酸微生物的生长代谢可以促进酸性蛋白酶的代谢生成，代谢生成的有机酸也为酯化反应提供前体物质。

表2 大曲在发酵过程中生化指标之间的相关性Table 2 The correlation between biochemical indexes of Daqu during fermentation

**.在0.01水平(双侧)上显著相关;*.在 0.05水平(双侧)上显著相关。

3 结论与展望

本文通过将中高温大曲拆分为曲皮与曲心，研究生化性能的差异及其在培菌发酵期间的变化趋势，发现中高温大曲部位间生化性能在成品曲和培菌发酵过程中都具有一定的规律性，且相互之间具有一定的相关性。主要结论如下：

(1)从结构上细分了中高温成品大曲的生化性能。曲皮的菌系最丰富，各类微生物均占优势，酶活也最高，但酯化力最低；曲心的细菌数量最低，糖化力与发酵力最低，酯化力最高；火圈的酵母和霉菌最少，以细菌为主，水分、酸度最大，酸性蛋白酶活力最低，其他性能居中。

(2)明晰中高温大曲不同部位的生化性能在培菌发酵过程的变化规律。主发酵期，酵母大量增殖，发酵力速升，曲心糖化力速降、酸度快速增加，曲皮水分快速散失；潮火期，发酵力速降，酯化力和酸性蛋白酶活力上升，酸度平缓，曲皮中的霉菌先升至峰值后回落、水分进一步降低；大火期，酶活和微生物数量都低，曲心的水分和酸度开始降低；落火后，酯化力、酸性蛋白酶活力和曲心糖化力有所回升；养曲期，糖化力继续上升，酯化力与酸性蛋白酶活力缓降，曲心水分进一步散失。

(3)研究发现中高温大曲的糖化力主要来自于曲皮，发酵力主要形成于主发酵阶段，酵母增殖也主要在主发酵阶段，霉菌增殖主要在潮火阶段，酯化力和酸性蛋白酶活力在大火初期达到峰值。

(4)相关性分析结果表明，糖化力与淀粉、细菌数量以及曲皮的水分和曲心的酵母之间都呈显著正相关，发酵力与水分、淀粉、酵母以及曲皮细菌数量显著正相关，发酵力、曲皮糖化力与曲心温度呈显著负相关，曲皮和曲心的酸性蛋白酶与曲心温度呈显著正相关，曲心中的酸性蛋白酶与酸度呈显著正相关，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力显著正相关。

为了全面了解中高温大曲微生物群落及其多酶体系演变的内在机理，还需要结合现代分子生物学方法和大曲功能微生物的分离鉴定与代谢分析，从而明晰中高温大曲生化功能形成的内在推动力，为制曲工艺优化和制曲方法现代化提供理论借鉴。