4种乳酸菌甜玉米乳清蛋白饮料发酵过程主要品质指标分析及感官评价

刘凤锦，卢兴，李玉霞，邵晓园，李高聪，陆延，张军

（1.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080；2.农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500；3.黑龙江佰益食品发展有限公司，哈尔滨150078）

0 引言

甜玉米是兼具果、蔬特性的谷物，含糖量高出普通玉米10倍，富含多种维生素，蛋白质含量较普通玉米高[1-2]。我国甜玉米深加工技术落后，产品形式单一，附加价值低[3]。开发甜玉米的精深加工技术，丰富产品的种类，扩大其利用水平和能力，是食品科技工作者和消费者共同关注的问题[4-5]。乳清蛋白在消化过程中产生多种生物活性多肽,具有增强体质、提高免疫力、抗疲劳、抗氧化、抑菌抗病毒、降血脂、降血压、降血糖、抗癌等多种保健功能[6]。利用乳酸菌和乳清蛋白提升甜玉米蛋白质效价开发出的甜玉米乳清蛋白发酵饮料，是现代发酵技术在谷物和乳制品混合原料深加工领域的具体应用，对提升适口性、储藏性和营养性具有重要意义，符合当前饮料的发展消费趋势，市场前景广阔[7-8]。为甜玉米资源的深加工利用开辟了新的应用途径[9]。

以往食品发酵技术研究的焦点都集中在发酵速率上，所以发酵菌种的筛选以产酸能力和速率为指标[10]。随着经济社会及科技进步，消费者营养与健康意识不断增强，营养、功能和感官评价已成为食品开发的综合体系，取代感官评价的片面做法[11]。

本研究以甜玉米粒和分离乳清蛋白粉为原料，以植物乳杆菌（L.plantarum）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、干酪乳杆菌（L.actobacilluscasei）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）为发酵菌种，通过分析发酵过程中pH；还原糖消耗量；可溶性蛋白，游离氨基氮；可滴定酸度主要品质指标的变化，并结合感官评价，综合评价不同菌种发酵甜玉米乳清蛋白饮料的特性，为进一步开发发酵乳品种做理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

直投式乳杆菌冻干粉：植物乳杆菌（L.plantarum）（DAN ISCO公司）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）(普尔斯天津国际贸易有限公司)、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）(普尔斯天津国际贸易有限公司)、干酪乳杆菌（L.actobacilluscasei）（普尔斯天津国际贸易有限公司），4种乳酸菌皆为兼性厌氧菌。

1.1.2 原材料及试剂

甜玉米粒（黑龙江佰益食品发展有限公司提供）；速溶乳清分离蛋白（蛋白质含量93%北京银河路经贸有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3Cp H计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PB203-N电子精密天平：梅特勒TU-1810型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HW S-12电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DNP-9082电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司

1.3 实验方法

1.3.1 甜玉米乳清蛋白发酵饮料制作方法

参照李凤林等[12]制备澄清型玉米发酵饮料工艺技术，结合甜玉米原料营养特性分析，采用如下方法，制备甜玉米发酵饮料。

1.3.2 操作要点

（1）室温下解冻甜玉米，在（水与甜玉米质量比为1∶4）预煮15 m in，料理机内打浆5 m in。

（2）乳清蛋白粉用45℃纯净水配制2%浓度液与甜玉米浆1∶1充分混合。

（3）将料液冷却到37℃左右接种，混合均匀后于37℃培养箱中培养。

1.3.3 感官评价

参照孙晓昕等[13]的方法，依据《GBT 16291.2-2010感官分析选拔、培训和管理评价员一般导则第2部分：专家评价员》、《GBT 16291.1-2012感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》选拔、培训5名评审专家和35名普通消费者评价员，对经L.plantarum、L.actobacillus casei、L.acidophilus、L.rhamnosus发酵12 h，并4℃冷藏24 h后的甜玉米乳清蛋白饮料，从香气、口感、色泽、状态4个方面进行感官评价，总共100分，评分标准详见表1[14]。

表1 甜玉米乳清蛋白发酵饮料感官品评标准表

1.3.4 过程指标分析

自发酵开始第0、2、4、6、8、10、12 h分别取样，并采用相应方法测定下列变量。

1.3.5 pH值的测定

采用pH计测定pH值。

1.3.6 可滴定酸度的测定

借鉴张莉丽等[15]方法，准确称量5.00 g发酵样品，置于100 m L三角瓶中，加入40 m L去CO2水，再加入2滴的0.5%酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用浓度为0.1 m ol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在30 s内不消失为止。消耗的浓度为0.1 m o l/L氢氧化钠标准溶液毫升数除以样品克数，再乘以1000，即得酸度（°T），取3次测定的平均值。

1.3.7 还原糖的测定

参照杨贵明等[16]的方法，配制一系列梯度浓度的葡萄糖标准溶液，在波长520 nm下测其吸光度，并绘制标准曲线及回归方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白发酵饮料，稀释10倍后，在相同条件下测定样品的吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线回归方程，计算乳酸菌发酵过程中还原糖含量，每组实验重复平行3次。

1.3.8 可溶性蛋白的测定

参照Sheih IC等[17]方法，配制一系列梯度浓度的牛血清蛋白标准溶液,在595 nm波长下测定其吸光度，并绘制牛血清蛋白的标准曲线及回归方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白发酵饮料，稀释10倍后，在相同条件下测定样品的吸光度值，根据牛血清蛋白的标准曲线回归方程，计算乳酸菌发酵过程中可溶性蛋白质含量，每组实验重复平行3次。

1.3.9 游离氨基氮的测定

参照Salm erón I等[18]的方法，进行一定改进，测定甜玉米乳清蛋白发酵饮料发酵过程中的游离氨基态氮。配置一系列梯度浓度的亮氨酸标准溶液,绘制亮氨酸的标准曲线及回归方程。每2 h取甜玉米乳清蛋白发酵饮料，稀释10倍后，按上述操作步骤测定样品的吸光值，根据标准曲线回归方程，计算乳酸菌发酵过程中游离氨基氮含量。

1.3.10 数据分析

数据处理用O riginPro8.5处理。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中pH值测定结果

图1 pH值变化曲线

图1 表明，甜玉米乳清蛋白发酵饮料起始pH值为6.85。L.rhamnosus发酵液，pH值下降速率最慢，前4 h基本没有变化，下降速率仅为0.16/h，发酵8 h，p H值为6.22，即使进一步发酵到12 h时pH值仍为4.93。L.plantarum在发酵过程中，前8 hpH值下降速率最快，pH值下降平均速率为0.31/h，在发酵2 h时，便开始急速下降，最早启动酸发酵过程，以最快速率到达发酵终点(p H=4.30)，发酵时间8 h，之后p H值基本不变，显示后酸化能力较弱。L.acidophilus、L.actobacillus casei发酵液pH值变化规律基本一致，L.acidophilus发酵8 h后也达到pH=4.30水平，pH下降速率为0.26/h，表现出和L.plantarum相近的酸发酵能力，不同的是，在8 h后p H值继续下降，后酸化能力较强。L.actobacillus casei发酵液pH下降速率较平稳为0.27/h，在经过12 h发酵后，pH下降到3.91。

2.2 发酵过程中可滴定酸度测定结果

图2 可滴定酸度变化曲线

图2 显示，相同条件下，4种发酵过程中可滴定酸度上升趋势基本一致，但是上升速率差别较大。L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料可滴定酸度上升速率在整个发酵过程中均高于其他几种，约为2.37°T/h，发酵12 h可滴定酸度为44.60°T，说明其发酵过程中产酸最快，与pH变化趋势相符合；L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料在发酵过程中，可滴定酸度上升速率最小，仅为1.82°T/h，产酸能力较差，验证了其在发酵过程中pH下降最慢的结果，发酵12 h可滴定酸度仅为38.10°T；L.actobacillus casei和L.acidophilus发酵液可滴定酸度上升速率分别为2.18°T/h和2.28°T/h，12 h可滴定酸度分别达到42.30°T和43.80°T。

2.3 发酵过程中还原糖消含量测定结果

图3 还原糖含量变化曲线

图3 表明，4种发酵液还原糖含量的变化，呈现下降-上升-平稳-下降的卧S型一致走势，区别在于变化程度，这与pH值及滴定酸度的变化趋势和强度相符，表明4种乳酸菌利用还原糖进行酸发酵能力有明显差异。L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量变化趋势前期基本一致，6 h后出现分化。L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量呈线性下降。L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料则在8 h后开始线性下降，且于10 h后趋于稳定。L.rhamnosus、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量变化趋势基本一致，仅在前2 h稍有下降后便开始上升，直至8 h开始线性急速下降。不同点在于L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量一直高于L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料，且在第4 h达到高峰值9.10 g/L，超出甜玉米乳清蛋白原液中的固有还原糖含量，显示其具有较强的淀粉降解能力，10 h后趋于稳定。在发酵前2h,L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量下降速率最快，分别为2.29 g/（L·h），2.35 g/（L·h），而L.rhamnosus、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖消耗速率较低，仅为1.18 g/（L·h），0.51g/(L·h）。在发酵2～4 h，L.plantarum、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量迅速增长，而L.actobacillus casei、L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量缓慢增长，说明在发酵过程中前2 h乳酸菌消耗存量还原糖含量至最低点后，开始产生新的还原糖，有了增量还原糖，并在发酵的4～8 h一直产生还原糖并保持含量处于6.50 g/L的相对高位，其中L.acidophilus发酵甜玉米乳清蛋白饮料还原糖含量在6 h以后呈现线性下降。在发酵10 h后，4种乳酸菌甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量均有较大幅度的减小，均下降到3.50 g/L左右的水平。10～12 h时，L.rhamnosus、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量继续下降，L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量又缓慢上升，而L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料还原糖含量基本不变。

2.4 发酵过程中可溶性蛋白测定结果

图4 可溶性蛋白含量变化曲线

由图4可知，4种乳酸菌发酵甜玉米乳清蛋白饮料的过程中，可溶性蛋白含量变化趋势基本一致，在发酵前2 h都呈下降趋势，其中L.acidophilus、L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量下降速率较大，分别约为2.60m g/(g·h)，2.43 m g/(g·h)。在发酵2～6 h阶段，除L.p lantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量继续下降至第4 h开始回升外，其余都在第2 h后开始回升，且L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量增长速率最快，约为1.85 m g/(g·h)。这可能是前期乳酸菌利用可溶性蛋白生长繁殖，致使可溶性蛋白含量下降，而当乳酸菌大量繁殖后，分泌蛋白酶进一步水解玉米中的蛋白质而使可溶性蛋白含量增高。在发酵6～10 h阶段，除了L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量继续增长至第8 h外，其他3种乳酸菌甜玉米乳清蛋白发酵饮料中可溶性蛋白含量均在减小。L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量在第8 h达到最高点23.20 m g/g后，和其余乳酸菌一样开始急速下降。4种乳酸菌甜玉米乳清蛋白发酵饮料可溶性蛋白含量在8～10 h期间都呈现出急速下降趋10 h后，下降速率明显减缓，12 h后均达到5.30 m g/g上下水平。

2.5 发酵过程中游离氨基氮测定结果

图5 游离氨基氮含量变化曲线

由图5可知，4种乳酸菌在相同发酵条件下，甜玉米乳清蛋白发酵饮料中游离氨基氮含量增减趋势接近一致。在发酵前4 h，游离氨基氮含量均很大程度地降低，由开始发酵的4.88 ug/m L减小为1.67 ug/m L。在4～6 h，游离氨基氮含量又开始迅速上升，并于第6 h达到顶点，普遍增长到4.20 ug/m L以上，其中L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料游离氨基氮含量最高，达到4.62 ug/m L。之后，L.plantarum、L.actobacillus casei在6～8 h发酵时间内，甜玉米乳清蛋白发酵饮料中游离氨基氮含量基本趋于稳定，分别保持在4.62 ug/m L，4.25 ug/m L，而L.rhamnosus、L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料中游离氨基氮含量呈线性下降，直至发酵到12 h时，最终达到1.00 ug/m L左右。L.plantarum、L.actobacillus casei甜玉米乳清蛋白发酵饮料游离氨基氮含量在发酵8 h后呈线性下降，且L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料中游离氨基氮含量在10 h后下降速率明显减缓，稳定在1.78 ug/m L水平；L.actobacillus casei发酵甜玉米乳清蛋白游离氨基氮含量也在10 h时开始减缓下降速度，在12 h时达到1.47 ug/m L。分析认为，这种变化过程同样是由于开始时，溶液中存量氨基酸被利用使得含量开始下降，之后随着乳酸菌的大量生长繁殖，开始分泌水解酶，继而分解蛋白质产生游离氨基酸，使氨基酸含量再次上升，而同时蛋白质总量开始下降。随着乳酸菌的继续生长繁殖，大量氨基酸被消耗利用，溶液中氨基酸含量持续下降。

2.6 感官评价结果

表2 甜玉米乳清蛋白发酵饮料的感官品评表（40人）

将发酵12 h后的L.plantarum、L.actobacillus casei、L.acidophilus和L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料，放入4℃冰箱中冷藏24 h，进行感官评价，结果如表2所示。由表2可以看出，L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料的品评得分最高为79.79分，L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料品评得分75.80最低。在状态和色泽方面四种菌的差别都不大，而在口感和香气方面有较明显差别。感官品评结果显示L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料，酸甜适口，发酵香气协调，而L.actobacillus casei，L.acidophilus甜玉米乳清蛋白发酵饮料酸甜失衡，发酵香味偏单一，酸味突出，风味淡薄，L.rhamnosus酸味不足，口感差别跟发酵前相近，因此感官品评也最低。

3 结论

甜玉米乳清蛋白发酵饮料发酵过程中，4种乳酸菌均表现为开始阶段利用原料中的还原糖和游离氨基氮成分进行生长繁殖并代谢乳酸，使p H值下降和可滴定酸度升高。但是，发酵能力差别较大。

同其他3种乳酸菌相比较，L.plantarum甜玉米乳清蛋白发酵饮料pH值下降速率最快、幅度最大，发酵8 h后，p H值下降到4.30，经感官评价酸味柔和协调，达到发酵饮料的适口水平，可作为甜玉米乳清蛋白发酵饮料的发酵终点。pH值于发酵后期趋于稳定，显示其后酸化能力较弱，利于保藏储存。还原糖消耗速率较快，游离氨基氮、可溶性蛋白含量在6～8 h发酵过程中保持最高水平，此时饮料有很好的营养价值以及协调而愉快的口感和风味。

L.rhamnosus甜玉米乳清蛋白发酵饮料pH值变化速率最慢，发酵12 h，p H值仅降低1.90，且游离氨基氮含量在发酵后期降低，所以其口感酸味不足，香气较淡，说明其发酵甜玉米浆能力较差。

L.acidophilus发酵过程中pH值降低速率较快，酸发酵能力较强，缺点是还原糖、可溶性蛋白及游离氨基氮含量都明显下降，营养功能较差。L.actobacillus casei在发酵过程中不论在产酸速率，还是还原糖消耗速率，游离氨基氮含量变化都较平稳，特点是可溶性蛋白含量在第8 h达到最大值，甚至超出甜玉米乳清蛋白饮料中的固有含量水平，游离氨基氮含量仅次于L.plantarum发酵液水平，在营养特性上有独特作用，但感官评价略次于L.plantarum，因此也可以作为发酵甜玉米乳清蛋白饮料的极具潜力备选发酵菌种。

虽然L.plantarum在甜玉米乳清蛋白发酵饮料发酵过程中性能优异，可以作为发酵甜玉米乳清蛋白的最佳发酵菌种，但是多菌种发酵体系更具有优越性，这几种乳酸菌的复合作用尚需进一步研究。