产蛋白酶乳酸菌发酵乳清蛋白产支链氨基酸的研究

2019-11-07王剑飞李理李宝磊周晴晴陈苏陈丽娥

中国乳品工业 2019年9期

王剑飞，李理，李宝磊，周晴晴，陈苏，陈丽娥

(1.黑龙江省绿色食品科学研究院哈尔滨150028；2.杭州娃哈哈集团有限公司食品科学研究院生物工程研究所，浙江省食品生物工程重点实验室，杭州310018)

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是广泛被认为是安全的一类微生物。乳酸菌在乳中的生长依赖于自身的蛋白水解系统降解乳蛋白来满足自身的生长需求[1]。乳酸菌产蛋白酶的性质对发酵乳的品质有重要影响，应用到发酵食品中，可以提高原料的酶解能力，产生许多风味物质前体和功能性成分—游离氨基酸，是筛选性质优良、稳定性强的工业生产菌株的主要指标[2]。支链氨基酸（branched am ino acid，BCAA），包括三种必需氨基酸，分别是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，在人体中不能合成，需从食物中获得。越来越多的证据表明，长时间的耐力运动主要是BCAA参与供能[3]。BCAA还可以促进运动中乳酸菌-葡萄糖循环以及糖异生的作用[4]，有利于减少骨骼肌中乳酸积累，延缓疲劳发生和促进运动后疲劳的消除[5]。

乳清蛋白是干酪加工过程中产生的副产品，以其易消化吸收、氨基酸组成合理、营养价值高等优点被称为“蛋白之王”[6]。乳清蛋白中BCAA含量较酪蛋白丰富，本研究在前期筛选获得一株高产蛋白酶的德氏乳杆菌乳亚种菌株的基础上，将其应用于发酵乳清蛋白，并研究了不同发酵时间BCAA的变化情况。获得的富含BCAA的发酵乳清蛋白液可作为运动饮料、发酵乳制品的功能性配料，提高产品附加值，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

MRS液体培养基20.0 g葡萄糖，22.5 g胰蛋白胨，5.0 g乙酸钠，2.0 g柠檬酸二铵，0.58 g硫酸镁，2.37 g三水磷酸氢二钾，0.28 g一水硫酸锰，0.5 g半胱氨酸，1.0 g吐温-80，蒸馏水定容至1 000 m L，调节pH值至5.8，121℃高压灭菌15 m in；改良MRS固体培养基，在液体培养基中添加1.5%的琼脂，脱脂乳粉、全脂乳粉、脱盐乳清粉（D 90）（恒天然（中国）有限公司）；浓缩乳清蛋白（丹麦ARLA乳品公司）；碱性蛋白酶2.4 L、风味蛋白酶Flavorzyme 1000L（诺维信（中国）生物技术有限公司）。

恒温培养箱（德国赛默飞世尔科技公司）；M u ltitron Standard通用型震荡培养箱（伊孚森生物技术（中国）有限公司）；M inifors Bacteria实验室台式标准发酵罐（伊孚森生物技术（中国）有限公司）；O ptim aTM XPN超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；Christ真空冷冻干燥机（北京博励有限公司）；氨基酸分析仪（安捷伦科技（中国）有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 产蛋白酶乳酸菌菌株

本研究所用菌株为实验室自主分离于西藏山区当地农户自制传统发酵乳制品中，经筛选得到的一株具有较高蛋白分解能力的德氏乳杆菌乳亚种（下称LB815）。该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGM CC N o.13750。

1.2.2 菌株高密度发酵条件确定

对培养基中碳源、氮源、发酵温度、发酵pH值、通气种类进行确定。

1.2.3 活菌数检测

对发酵后的菌悬液直接进行生理盐水梯度稀释，并涂布于MRS固体培养基中，37℃恒温培养24 h后，选择菌落数为30～300的稀释梯度进行计数。

1.2.4 高活性冻干菌粉制备

采用改良M RS液体培养基对菌株LB815进行活化与传代（37℃，培养12 h），所得培养物经梯度稀释后涂布于MRS固体培养基上，37℃培养至有单菌落形成，4℃保存备用。

取单菌落至10 m L M RS改良液体培养基，37℃培养12 h，所得培养物1%（体积比）接种至50 m L MRS改良液体培养基，37℃培养12 h，所得培养物1%（体积比）接种至200 m L MRS改良液体培养基，37℃培养12 h后将所得培养物全部接种于发酵罐中，37℃，恒定pH值（氨水调节）发酵18 h（对数生长后期）。发酵液8 000 r/m in，离心10 m in，收集菌泥，菌泥与保护剂按一定比例混匀后倒入平皿，至冻干机进行冻干。获得的冻干菌粉进行活菌计数，并密封保存于-30℃备用。

1.2.5 发酵乳清蛋白液

配置质量分数10%的乳清蛋白溶液，均质后冷却至43℃，接入LB815菌粉，调整活菌数为3.0×106cfu/m L，43℃静止发酵24 h。4℃保存，检测氨基酸含量，并进行感官评价。

1.2.6 氨基酸含量检测

样品前处理：准确称量发酵乳样品2.5 g，10%磺基水杨酸（0.02m o l/L HC l配置）定容至10 m L，室温静置10 m in后，取2 m L离心，离心得上清0.22 um有机滤膜处理后，待上机检测。色谱条件及数据分析参考文献方法[7]。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株

菌株LB815在M RS固体培养基上可形成圆形、边缘整齐的半透明菌。菌悬液在乳清蛋白水琼脂平板上可形成明显的水解圈，且水解圈直径大于其他菌株，说明该菌株对乳清蛋白有较强分解能力[8]。

2.2 培养基中碳、氮源对菌株LB815生长的影响

根据前期API50实验结果，以菌株LB815可利用的糖，分别为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、果糖、乳糖和麦芽糖为碳源发酵，其他成分同M RS液体培养基。取菌悬液稀释涂布，计活菌数，结果如图1所示。

图1 碳源对LB815生长的影响

以果糖为碳源，牛肉浸粉、酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨单体或复配（单体较好的两种）为氮源，其他成分同MRS液体培养基。取菌悬液稀释涂布，计其活菌数，结果如图2所示。

图2 氮源对LB815生长的影响

2.3 发酵温度对菌株LB815生长的影响

设定发酵温度为34、37、40、43℃，以果糖为碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨为复合氮源，通N2，150 r/m in搅拌，pH值为5.5，进行发酵。取菌悬液稀释涂布，计活菌数，结果如图3所示。

2.4 发酵p H值对菌株LB815生长的影响

设定发酵控制p H值为5.0、5.5、6.0、6.5，温度为37℃，以果糖为碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨为复合氮源，通N2，150 r/m in搅拌进行发酵。取菌悬液稀释涂布，计活菌数，结果如图4所示。

图3 发酵温度对LB815生长的影响

图4 发酵pH值对LB菌株815生长的影响

2.5 通气种类对菌株LB815生长的影响

设定通气种类分别为不通气、CO2、N2，温度为37℃，以果糖为碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨为复合氮源，150 r/m in搅拌进行发酵。取菌悬液稀释涂布，计活菌数，结果如图5所示。

图5 通气种类对LB815生长的影响

综合以上结果，菌株LB815高密度培养条件为：果糖为碳源、牛肉浸粉和大豆蛋白胨为复合氮源、发酵温度37℃、pH值恒定为5.5、通氮气。该发酵条件下，菌悬液活菌数为2.63×109cfu/m L，冷冻干燥后菌粉活菌数为2.93×109cfu/m L。

2.6 BCAA含量随发酵时间变化情况

发酵过程中取样检测BCAA和总游离氨基酸含量，如图6所示。结果发现，从发酵5 h开始积累BCAA至26 h达到最高值，随后缓慢下降。3种氨基酸的组成，以亮氨酸最多，缬氨酸次之，异亮氨酸最少，BCAA总量最高可达到312.55 m g/kg。关于通过乳酸菌发酵乳清蛋白获得BCAA的相关报道较少，王豪[9]等人，以生牛乳混合分离乳清蛋白为基料，发酵乳杆菌PCC为发酵菌种制备的发酵乳饮料中BCAA的含量仅为73.2 m g/kg。