采后乙烯脱绿处理“尤力克”柠檬

刘路，刘孝平，黄磊，王爱华，孙恒嵩，付云云，陈安均

(四川农业大学，四川 雅安，625014)

柠檬(Citruslimon(L.) Burm. F.)为芸香科柑橘属常绿小乔木，在世界柑橘业中排在第3位[1]。尤力克柠檬是柠檬种子的实生变异，原产于美国，是世界上培育面积最广、产量最多的品种[2]。果实套袋是一种物理保护方法，在果实生产发育过程中，阻隔了果面与外界的接触[3]，可以保护果实不受病虫危害，使果面着色均匀[4]，套袋技术已在梨[5]、猕猴桃[6]等水果栽培中得到了广泛的应用，但是套袋处理可以抑制抗坏血酸的积累以及抑制一些糖和有机酸的合成[7]。柠檬主要以鲜果销售为主，大部分在充分成熟以前、含酸量最高时采收，此时果皮呈绿色，商品品质欠佳。适当早采收的柠檬虽固酸比已达到成熟水平且口感宜人，但果皮却为绿色，尤其南方地区果实成熟季节高温多湿(特别是夜间高温)，常干扰柑桔果皮特有色泽的呈现，果面呈黄绿相间的斑驳状。因此，柠檬的脱绿处理便成了一种迎合顾客消费观的手段[8]。柠檬脱绿是利用激素的刺激，促进转化酶的活动,促使果皮中叶绿素降解和类胡萝卜素显现的过程，从而缩短果皮由绿变黄的时间。

套袋已被广泛应用于水果作物以改善水果品质，套袋处理可使血橙的总花青素浓度增加，而总可溶性固形物、总酚、抗坏血酸浓度和可滴定酸度随着套袋处理而降低[9]。乙烯及脱落酸等激素脱绿在柑橘采后也有报道，乙烯利脱绿后，可溶性固形物、总酸、抗坏血酸含量略有波动，但尚未发现不良影响[7]。但是乙烯利处理的柑橘果实脱绿时间长，蜜柑乙烯利脱绿时间长达9 d[10],因此本实验采用乙烯脱绿处理，缩短脱绿时间的同时可以有效改善柠檬的果皮色泽。

本文研究了乙烯脱绿处理对尤力克柠檬果皮颜色以及内部品质的影响，发现乙烯脱绿处理可以有效改善尤力克柠檬的果皮颜色，且对尤力克柠檬果实的内在品质尚无不良影响，该研究可为乙烯脱绿处理在柠檬上的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

“尤力克”柠檬于2018年11月2日采自四川省安岳县姚市柠檬果园，在果园的不同方位选取果树，并在果树的不同方位摘取套袋及非套袋(青)柠檬，大小均一、无机械损伤、成熟度适中(TSS>8，质量为140～180 g)的夏花果，果袋购自四川眉山市冠荣制袋有限公司。

乙烯：95%纯度，南京上元工业气体厂；2,4-二氯苯氧乙酸、CuSO4、K2SO4、H2SO4、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、NaOH、乙醇、福林酚试剂、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3、芦丁、没食子酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、硫代巴比妥酸、丙酮、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、草酸、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚：分析纯，成都科龙化工试剂厂；2,4-D试剂盒，深圳容金科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

TA.XTPlus物性分析仪，英国StabieMicro System公司；Varioskan Flash酶标仪,美国Thermo公司；Ulupure超纯水仪，成都优普；X3R高速冷冻离心机，美国安捷伦公司；HP-C226色差仪，上海谱熙光电科技有限公司；S-433D全自动氨基酸分析仪，德国赛卡姆公司；CX21生物显微镜,日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 实验材料预处理

将采摘下来的柠檬用质量浓度20 g/L的次氯酸钠溶液浸泡1～2 min，消毒杀菌，清洗干净后置于20 ℃下自然风干，将果实分组，套袋柠檬为一组，青柠檬分为2组，分别为对照组与采后乙烯脱绿组。采后乙烯脱绿组是将柠檬用质量浓度30 mg/L的2,4-D浸泡2 min，风干后移入脱绿室中，脱绿室条件为：乙烯质量浓度为5 mg/L，温度为28 ℃，湿度为95%，CO2浓度小于0.3%，处理时间为5 d，采用2,4-D试剂盒测定其2,4-D残留量，其残留量低于国标的1 mg/kg。

1.2.2 指标测定

色差的测定：采用精密色差仪测定柠檬赤道周围4个点。

外观的观察拍照以及果皮的组织观察：拍照采用尼康D7100相机，果皮组织观察用生物显微镜进行观察。

抗坏血酸的测定：根据GB 5009.86—2016[11]测定。

总酸的测定：根据GB/T 12456—2008[12]测定。

可溶性固形物含量的测定：使用阿贝折光仪进行测定。

硬度的测定：用TA.XTPLus物性分析仪测定柠檬赤道周围4个点的硬度，选用P5探头，测试前、中、后速度分别为1、5、5 mm/s，位移为20 mm，时间为5 s，触发力10 g，高度校正的返回距离为70 mm，速度10 mm/s，TPA结果采用仪器自带宏程序TPA-macro分析。

叶绿素、类胡萝卜素的测定：根据文献[13]修改如下，称取1 g果皮置于研钵中，加入液氮、石英砂及含0.1‰BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的丙酮溶液研磨成匀浆，经过多次研磨使组织发白，于4 000g离心10 min，取上清液定容至25 mL，用酶标仪分别测470、645、662 nm处的吸光值。按照公式(1)(2)(3)分别计算叶绿素a、叶绿素b，类胡萝卜素含量。

Ca=11.75A662-2.35A645

(1)

Cb=18.61A645-3.96A662

(2)

(3)

式中：Ca，叶绿素a含量;Cb，叶绿素b含量;Cxc，类胡萝卜素含量;A662，662 nm处的吸光值;A645，645 nm处的吸光值;A470，470 nm处的吸光值。

蛋白质的测定：根据GB 5009.5—2016[14]测定。

氨基酸的测定：根据GB 5009.124—2016[15]测定。

总酚、黄酮的测定：根据文献[16-17]修改如下，总酚采用Folin-Ciocalteus法，取样品1 g，加入80%的甲醇研磨，离心后定容至10 mL，作为提取液，取提取液0.8 mL加入4 mL稀释10倍的Folin-Ciocalteus试剂混合均匀，5 min后加入100 g/L的Na2CO3溶液6 mL，常温放置1 h，果皮稀释2倍，果肉不稀释，于765 nm处测定吸光值，以体积分数80%甲醇为对照，以没食子酸为标曲，样品中总酚含量以每千克鲜重含毫克没食子酸当量表示(mg GA/g FW)。黄酮的测定：取提取液0.5 mL，加入4.5 mL体积分数30%乙醇，再加0.4 mL 50 g/L NaNO2摇匀，5 min后，加0.4 mL 100 g/L Al(NO3)3摇匀，6 min后，加0.4 mL, 1 mol/L NaOH，用体积分数30%乙醇定容至10 mL，放置15 min，测定510 nm处吸光值。

丙二醛的测定：根据文献[18]修改如下：称取样品5 g。置于具塞锥形瓶中，准确加入50 mL三氯乙酸溶液，摇匀，加塞密封，置于恒温振荡器中振荡30 min，冷却、过滤备用。取5 mL滤液，5 mL三氯乙酸混合液为样品空白，分别加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，水浴10 min，取出冷却至室温，测定450、532、600 nm处测定吸光值。根据公式(4)计算丙二醛含量。

C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450

(4)

式中：A532，532 nm处的吸光值；A600，600 nm处的吸光值；A450，450 nm处的吸光值。

1.2.3 数据分析

使用Origin 8.1、SPSS等软件处理实验数据，P<0.05表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 脱绿处理对尤力克柠檬外在指标的影响

如图1、图2所示，脱绿组柠檬的硬度显著低于套袋组和对照组，这可能是脱绿过程中乙烯作用所导致的结果。套袋组柠檬的亮度显著高于脱绿组和对照组，对照组柠檬的红绿色度显著低于套袋组和脱绿组，呈现出负值，这是由于对照组的柠檬为绿色。对照组柠檬的叶绿素a，显著高于套袋组和脱绿组；对照组柠檬的叶绿素b显著高于套袋组和脱绿组，对照组类胡萝卜素含量显著低于套袋组，套袋组显著低于脱绿组，说明在采后脱绿过程中，大部分叶绿素a和叶绿素b已降解，类胡萝卜素大量合成，导致柠檬果皮颜色发生变化，表现为红绿色度的提高。通过显微镜观察可以发现，对照组果皮组织结构中有很多叶绿体，在脱绿组和套袋组中并没有发现叶绿体，说明叶绿素的降解与叶绿体的消失有关。

图1 脱绿处理对尤力克柠檬外在指标的影响Fig.1 Effect of de-greening treatment on the external indicators of Eureka lemon注：不同字母表示显著性差异(P<0.05)。下同。

图2 脱绿处理对尤力克柠檬内在品质的影响Fig.2 Effect of de-greening treatment on the internal index of Eureka lemon

2.2 脱绿处理对尤力克柠檬内在品质的影响

糖酸是柑橘类果实的主要营养物质，柑橘类果实缺乏储备型碳水化合物，而是以可溶性糖的积累为主，它的可溶性糖主要来源于叶片的光合作用产物[19]，3组柠檬的可溶性固形物含量无显著性差异。脱绿组与对照组的抗坏血酸含量和总酸含量均高于套袋组。说明脱绿组在内在品质方面优于套袋组。

2.3 脱绿处理对尤力克柠檬蛋白质、氨基酸、活性物质以及丙二醛含量的影响

脱绿处理对尤力克柠檬蛋白质的影响如图3所示，脱绿处理对尤力克柠檬的果皮与果肉中的蛋白质含量无显著性影响，尤力克柠檬的果皮中蛋白质含量约为果肉中蛋白质含量的2倍。

图3 脱绿处理对尤力克柠檬不同部位蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of de-greening treatment on protein content in different parts of Eureka lemon注：相同字母表示无显著性差异(P<0.05)。

氨基酸是重要的营养成分之一，不同的含量和组分直接影响其营养价值及保健价值[20]。尤力克柠檬果肉中的氨基酸种类较齐全，本实验测定的17种氨基酸在脱绿组、套袋组以及对照组柠檬果肉中均可检出(表1)，但是在含量上略有差异，对照组和脱绿组柠檬中氨基酸的总量无显著性差异，但是对照组与脱绿组氨基酸总量均显著大于套袋组，这可能与套袋组在生长过程中的光照少于对照组与脱绿组有关。在对照组和脱绿组的果皮中未检测到苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸，但是脱绿组柠檬果皮中氨基酸总量显著高于套袋组和对照组。果皮中的氨基酸总量显著高于果肉中的氨基酸总量，因为氨基酸是组成蛋白质的最小单位，因此这与果皮中蛋白质含量显著高于果肉中的蛋白质含量相呼应总酚和黄酮均具有抗氧化活性，可以预防一些慢性病的发生。脱绿处理对尤力克柠檬活性物质的影响如图4，黄酮与总酚在果皮中的含量均显著高于果肉中含量，这与高炜等[21]研究的结果相符合。脱绿组果皮中的总酚显著高于对照组果皮中的总酚含量，黄酮在果皮中含量为：脱绿组>对照组>套袋组，说明脱绿处理可以显著提高总酚和黄酮等活性物质的含量。

表1 脱绿处理对尤力克柠檬氨基酸含量的影响 单位：mg/100 g

注：ND表示未检出。

丙二醛含量代表植物的衰老程度，丙二醛含量越高，说明植物的衰老程度越高，脱绿组柠檬果皮与果肉中的丙二醛含量在套袋组和对照组之间，对照组果皮与果肉中的丙二醛含量均为最低，可以得出对照组的衰老程度较套袋组和脱绿组低(图5)。

3 讨论

采后脱绿处理对尤力克柠檬的可溶性固形物含量、总酸、抗坏血酸等内在品质无显著性影响，且总酸及抗坏血酸的含量显著高于套袋处理的柠檬，这与ZHANG P等[7]的研究结果一致。

图4 脱绿处理对尤力克柠檬活性物质的影响Fig.4 Effect of de-greening treatment on active subst-ances of Euclid lemon

图5 脱绿处理对尤力克柠檬丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of de-greening treatment on the content of malondialdehyde in eucalyptus

从外在指标看，脱绿处理可以显著降低果皮中叶绿素的含量并且促进类胡萝卜素的合成，从而提高了a*值，本实验结果与袁梓洢等[22]的研究结果一致，但是脱绿处理显著降低了尤力克柠檬果实的硬度，可能是乙烯脱绿处理加速了柠檬果实的衰老，该结果也与丙二醛含量显著增加相呼应。

氨基酸是构成生物体大分子蛋白质的基本单位，对机体的生命活动起着重要的作用，17种氨基酸均在尤力克柠檬果肉中被检出，可见尤力克柠檬具有重要的营养及保健价值。脱绿处理不会造成蛋白质的降解，未经套袋处理的柠檬果皮中未检出甲硫氨酸、异亮氨酸，可能这2种氨基酸的合成与光照存在一定的关系。脱绿处理显著提高了尤力克柠檬果皮中黄酮和总酚的含量，曲文颖等[23]的研究表明，一定浓度的乙烯利可以促进黄酮和总酚在蓝莓中的积累，与本实验结果相符，也有研究表明[7]，乙烯利处理柠檬可以增加其抗氧化能力，这可能与总酚和黄酮的积累有关。

4 结论

乙烯脱绿处理后有效改善了柠檬的外部颜色，促进了叶绿素的分解，以及类胡萝卜素的合成。除此之外，还发现乙烯脱绿组的黄酮与总酚含量显著高于套袋组与对照组。套袋处理增加了果实的生产成本，且造成了一定的资源浪费以及环境污染问题，不仅如此，套袋处理还会抑制抗坏血酸的积累以及抑制一些糖和有机酸的合成。采后脱绿处理可以减少生产过程中的套袋环节，并且可以达到或者大于套袋处理的柠檬果实的品质。该研究表明，采后乙烯脱绿处理是一种有效且经济的方法，可以改善柠檬果皮颜色以及柠檬果实品质。