UV-C辐照对凡纳滨对虾虾头主要内源酶酶学性质的影响

王贺，曹文红,2,3,4*，章超桦,2,3,4，秦小明,2,3,4，郑惠娜,2,3,4，高加龙,2,3,4

1(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088)2(广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江，524088)3(广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江，524088)4(水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江，524088)

在对虾加工过程中，产生约占机体总质量30%～40%的虾头副产物[1]。对虾的生理结构独特，头部分布消化道、消化腺等消化系统，含有丰富的内源酶[2]。前期研究表明，UV-C辐照可提高虾头内源蛋白酶酶活，但对不同种类内源酶的作用尚不清楚[3]。UV-C波段波长为190～280 nm，有强烈的杀菌作用，可使蛋白质和DNA变性。UV-C辐照是一种应用广泛的食品保鲜技术[4],可引起酶蛋白的变性，易导致蛋白酶失活。但一些研究显示，适度剂量的UV-C会对生物酶具有激活作用。用UV-C辐照南极黄丝瓜藓，其过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和过氧化物酶的酶活性均显著升高[5]，经UV-C辐照后的银杏叶的抗氧化活性显著提高[6]。课题组开发了基于UV-C辐照和梯度温度实现蛋白质高效回收的虾头快速自溶技术[7-8]，以凡纳滨对虾虾头为研究对象，检测分析UV-C辐照对虾头主要内源酶酶学性质及酶活的影响规律，为UV-C辐照激活虾头内源酶的机制研究及虾头酶制剂的开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾头：鲜活凡纳滨对虾，购于湛江市湖光镇市场，活体摘取虾头；福林酚试剂，北京鼎国生物科技有限公司；Chitin和牛血红蛋白，Sigma公司；蜗牛酶、棕榈酸对硝基苯酯、L-酪氨酸和甘氨酸，上海源叶生物有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

HH-4A型数显恒温水浴锅,常州国华电器有限公司；PHSJ-4F型精密pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-2550UV-C可见分光光度计,上海旦鼎国际贸易有限公司；T-18型分散机,上海珂淮仪器有限公司；TGL 16M型台式高速冷冻离心机,长沙英泰仪器有限公司；30 W紫外灯(波长253.7 nm),广东雪莱特光电科股份有限公司；Varioskan Flash型全自动酶标仪,美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 虾头UV-C辐照的方法

UV-C辐照虾头促进内源酶活力参考CAO[7]等的方法。取虾头匀浆，平铺于托盘上(虾浆厚度小于5 mm)，置于紫外灯下辐照以激活内源酶(UV-C辐照条件：紫外灯功率30 W，紫外灯高于托盘20 cm，辐照时间20 min)。温度和pH对内源酶酶活影响较大，故以UV-C辐照、温度和pH为条件测定酶活，探究其对内源酶的影响。

1.3.2 虾头内源酶液初步提取

内源酸性蛋白酶酶液提取：将虾头在低温条件下匀浆，按体积比1∶3加入预冷(4 ℃)0.05 mol/L pH 3的甘氨酸-HCl缓冲液均质，在高速冷冻离心机以4 ℃、9 000 r/min离心10 min，上清液即为初步提取酶液。

内源碱性蛋白酶酶液提取：将虾头在低温条件下匀浆，按体积比1∶3加入预冷(4 ℃)0.05 mol/L pH 8的磷酸盐缓冲液均质，在高速冷冻离心机以4 ℃、9 000 r/min离心10 min，上清液即为初步提取酶液[9]。

内源脂肪酶酶液提取：按虾头和缓冲液体积比1∶2加入预冷(4 ℃)的 0.05 mol/L pH 8的Tris-HCl缓冲液，均质，在高速冷冻离心机以10 000 r/min、4 ℃离心25 min，重复2次，取上清液，即为粗酶液[10-12]。

内源几丁质酶酶液提取：将虾头按体积比1∶4加入20 mmol/L pH 5的醋酸钠缓冲液，在组织捣碎机中匀浆后速冻至0 ℃。解冻后在4 ℃抽提1 h，以8 000 r/min离心15 min，取上清液[13]。

内源多酚氧化酶酶液提取：虾头在低温条件下匀浆，加入2.5倍体积的0.067 mol/L磷酸缓冲液(0 ℃，pH 7.2)进行匀浆，匀浆后在4 ℃、10 000 r/min下离心30 min，合并上清液即为粗酶提取液[14-16]。

1.3.3 内源酶酶活力检测

1.3.3.1 酸性蛋白酶酶活力检测

准确配制所需pH的0.5%(体积分数)的血红蛋白溶液。取3支试管分别加入经稀释后的酶液20 μL、血红蛋白溶液1 mL，室温(25 ℃)下反应20 min，加入0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)0.5 mL终止反应，常温下以10 000 r/min离心20 min，在280 nm波长处检测吸光值。

1.3.3.2 碱性蛋白酶活力检测

准确配制所需pH的2%(体积分数)的酪蛋白溶液。将1 mL 2%酪蛋白溶液于相应温度下预热5 min，然后加入1 mL经稀释后的粗酶液于相应最适温度下保温20 min，加入2 mL 0.4 mol/L TCA终止反应，继续保温10 min使残余蛋白质沉淀完全，然后于常温下以10 000 r/min离心15 min，取1mL上清液根据标准曲线的测定方法进行测定，空白溶液的配制：将1 mL酶液保温5 min，加入2 mL TCA，然后加入1 mL 2%酪蛋白溶液，静置10 min，于常温下以10 000 r/min离心15 min，上清液即为空白溶液。取上清液1 mL于500 nm波长处检测吸光值。

1.3.3.3 脂肪酶酶活力检测

取4-硝基苯磷酸二钠(pNPP)底物溶液，加入1 mL 0.05 moL/L pH 8的Tris-HCl溶液，混合均匀，37 ℃稳定2 min。在平行样中加入300 μL酶液，37 ℃水浴反应15 min。在空白管内加入300 μL已经灭活的酶，并将所有的管放入-20 ℃保持5 min以终止反应。在410 nm波长下测定吸光值。

1.3.3.4 几丁质酶酶活力检测

取3支试管，分别加入0.05 mol/L醋酸缓冲液、1%(体积分数)胶体几丁质、粗酶液各50 μL，37 ℃水浴反应2 h，4 000 r/min离心10 min终止反应。取上述反应的上清液50 μL，加入5 μL 1%(体积分数)蜗牛酶溶液，在37 ℃水浴反应30 min；随后加入25 μL饱和硼砂溶液，沸水浴7 min；待冷却后，向试管内加入250 μL冰醋酸、125 μL 1%(体积分数)对二氨基苯甲醛(DMAB)溶液，并在37 ℃水浴中反应15 min；在585 nm波长处测定吸光值。

1.3.3.5 多酚氧化酶酶活力检测

准确配制0.5 moL/L儿茶酚溶液、0.5 moL/LL-脯氨酸溶液和0.067 moL/L磷酸盐溶液，取3支试管，先后加入2.2 mL磷酸缓冲液、0.2 mLL-脯氨酸、0.2 mL儿茶酚，以及0.4 mL酶液，将试管置于37 ℃恒温水浴中10 min；然后将反应溶液置于比色皿中，在530 nm波长下测定吸光值。

1.4 UV-C辐照前后pH和温度对内源酶酶活力的影响

取新鲜虾头匀浆，探究UV-C辐照前后pH对内源酶的影响，经过UV-C辐照后，蛋白酶在40 ℃分别取pH 2～10测定酶活力。脂肪酶在40 ℃分别取pH 6～11测定酶活力。几丁质酶在37 ℃分别取pH 3～9测定酶活力。多酚氧化酶在37 ℃分别取pH 6～10测定酶活力。不经过UV-C辐照作为对照组，其余操作与上述相同。探究UV-C辐照前后温度对内源酶的影响，经UV-C辐照后蛋白酶分别在最适pH 3和pH 8 于10～70 ℃下测定酶活力；脂肪酶在pH 10于20～70 ℃测定酶活力。几丁质酶在pH 5于20～60 ℃测定酶活力。多酚氧化酶在pH 6于25～75 ℃下测定酶活力。不经过UV-C辐照作为对照组，其余操作与上述相同。

1.5 数据统计分析

每个实验重复3次，数据用“平均值±标准差”表示；采用Excel 2010进行标准偏差分析和作图，UV-C辐照前后的酶活差异性采用SPSS 20.0 软件进行t检验，P<0.05为显著差异(*)，P<0.01为极显著差异(**)。

2 结果与分析

2.1 pH和温度对UV-C辐照前后凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶酶学性质的影响

pH和温度是影响蛋白酶酶活力的重要因素。UV-C辐照前后在pH 2～11之间虾头的蛋白酶活性如图1所示。

图1 pH对UV-C辐照前后虾头内源蛋白酶酶活的影响Fig.1 Effect of pH on the activity of the endogenous protease in shrimp head before and after UV-C irradiation注：**表示在P<0.05水平上具有显著性差异；“表示在P<0.01水平上具有极显著性差异。下同。

UV-C辐照前后虾头的内源蛋白酶在酸性、碱性范围内均存在蛋白酶活性峰，其中酸性蛋白酶在pH 3～6左右，随着pH值的升高，酶活力逐渐变弱，而UV-C辐照前后活性峰都在pH 3左右，和本团队前期研究结果研究相同[17]。说明凡纳滨对虾酸性蛋白酶最适pH为3。碱性蛋白酶活性峰在pH 8～10之间，随着pH值再升高，酶活力逐渐下降，且UV-C辐照前后最适pH无明显变化，与庄志凯的研究结果相似[9]，比DADSHAHI等从凡纳滨对虾中提取出的一种新型热稳定性蛋白酶的最适pH值7略高[18]，可能与生活环境有关。如图2所示，在pH 3、温度60 ℃虾头内源酸性蛋白酶经UV-C辐照后酶活力(408.93 U/g)极显著高于未经过UV-C辐照的虾头内源蛋白酶(329.81 U/g)(P<0.01)，提高了23.99%。在其他温度下，UV-C辐照后虾头内源蛋白酶的活力也均不同程度地高于未UV-C辐照的对照组；酸性蛋白酶的最适温度为50～70 ℃左右，与沈文英所研究的最适温度37 ℃相比略高[19]。图3为不同温度条件下UV-C辐照前后虾头内源碱性蛋白酶的酶活力变化，结果显示内源碱性蛋白酶(pH 8)在30、40、60 ℃时酶活力显著提高(P<0.05)，在40 ℃时由2 253.45 U/g上升为3 098.24 U/g，提高了37.49%，其最适温度在40～60 ℃。研究发现海洋碱性蛋白酶最适温度60 ℃[20]，潘滨等也研究发现凡纳滨对虾碱性蛋白酶最适温度为40～60 ℃[21]，说明碱性蛋白酶在此温度范围内都有较高酶活。UV-C辐照能够促进虾头自溶[22]，且UV-C辐照前后不同温度、pH下的酶活力变化数据表明，UV-C辐照能进一步提高虾头中原有活性蛋白酶的酶活，但不能激活新的内源蛋白酶。

图2 温度对UV-C辐照前后虾头内源酸性蛋白酶酶活的影响Fig.2 Effect of temperature on the activity of the endogenous acid protease in shrimp head before and after UV-C irradiation

图3 温度对UV-C辐照前后虾头内源碱性蛋白酶酶活的影响Fig.3 Effect of temperature on the activity of the endogenous alkaline protease in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.2 pH和温度对UV-C辐照前后凡纳滨对虾虾头内源脂肪酶酶学性质的影响

在pH 6～11脂肪酶酶活力变化如图4所示，脂肪酶的活性总体先增加后降低，在pH 6～11，40 ℃时UV-C辐照大部分极显著高于对照组。其中pH 8酶活力由2.17 U/g上升为5.28 U/g提高了143.32%(P<0.01)。pH 10时酶活力由5.24 U/g上升为6.36 U/g，提高了21.37%(P<0.01)。脂肪酶酶活力最适pH为10左右，和南极磷虾相似，但是最适温度比南极磷虾高[11]，可能是它们生活环境所致。经UV-C辐照后，在pH为6～10时虾头均显示出较高的脂肪酶活性，且最适pH范围扩大。由图5所知，不同温度下的酶活力先升高后降低，表明脂肪酶活化分子在一定范围内随着温度的增加而增加，从而使催化反应加快，但是脂肪酶处于高温情况下容易变性失活进而导致酶活力降低。在温度为40 ℃左右时酶反应速率最高；50 ℃以后，酶活力下降。在温度为70 ℃时酶失活，与其他学者研究结果相似[23]。经UV-C辐照后，在20、40和50 ℃酶活力极显著提高(P<0.01)。其中20 ℃时，酶活力由1.36 U/g上升为2.11 U/g，提高了55.15%。50 ℃时酶活力由0.85 U/g上升为1.69 U/g，提高了98.82%。UV-C辐照对虾头内源脂肪酶的最适pH范围有所扩大，但最适温度无显著变化。

图4 pH对UV-C辐照前后虾头内源脂肪酶酶活的影响Fig.4 Effect of pH on the activity of the endogenous lipase in shrimp head before and after UV-C irradiation

图5 温度对UV-C辐照前后虾头内源脂肪酶酶活的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity of the endogenous lipase in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.3 pH和温度对UV-C辐照前后凡纳滨对虾虾头内源几丁质酶酶学性质的影响

几丁质代谢与虾的生长密切相关，它在虾壳中合成、裂解[24]、体液调节过程中起重要作用[25]。虾头中含有几丁质酶并且肝胰腺中酶活力较高[26]。由图6所知，UV-C辐照前几丁质酶最适pH为5左右，与脊尾白虾中最适pH值相似[13]，日本囊对虾几丁质酶最适pH 6.7[27]。经UV-C辐照后最适pH变为6左右。在40 ℃、pH 6时UV-C辐照后几丁质酶酶活力由3.74 U/g上升为5.15 U/g，提高了37.70%，酶活力显著提高(P<0.05)。由图7所示，几丁质酶最适作用温度为40 ℃，与罗氏沼虾[28]和脊尾白虾[13]的最适温度类似。在pH 6、不同温度下，经UV-C辐照后酶活力都有极显著差异，其中20 ℃时，UV-C辐照后酶活力由3.67 U/g上升为5.12 U/g，提高了39.51%(P<0.01)。30 ℃时，UV-C辐照后酶活力由3.76 U/g上升为4.89 U/g，提高了30.05%(P<0.01)。60 ℃时，UV-C辐照后酶活力由3.75 U/g上升为4.65 U/g，提高了24.00%(P<0.01)。因此，UV-C辐照对虾头几丁质酶具有显著的激活作用，对其最适pH有所影响，对其最适温度的影响不明显。

图6 pH对UV-C辐照前后虾头内源几丁质酶酶活的影响Fig.6 Effect of pH on the activity of the endogenous chitinase in shrimp head before and after UV-C irradiation

图7 温度对UV-C辐照前后虾头内源几丁质酶酶活的影响Fig.7 Effect of temperature on the activity of the endogenous chitinase in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.4 pH和温度对UV-C辐照前后凡纳滨对虾虾头内源多酚氧化酶酶学性质的影响

UV-C辐照前后凡纳滨对虾虾头内源多酚氧化酶在不同pH条件下的酶活力变化如图8所示，UV-C辐照前后多酚氧化酶酶活力在pH 6～10都存在一个活性峰，其最适pH为8，与东海中华管鞭虾最适pH 7.5相近[29]；在经过UV-C辐照后酶活力均显著提高，在pH为8时酶活力，由47.29 U/g提高到69.29 U/g，提升了46.52%(P<0.01)。图9为pH 8时不同温度对虾头内源多酚氧化酶活力的影响，在25～75 ℃的范围内，随着温度的升高多酚氧化酶酶活力呈下降趋势，但在75 ℃尚未完全失活，与CARVALHO等人的研究结果相似[30]。在温度为35 ℃时，经UV-C辐照后酶活由42.44 U/g上升为54.54 U/g，提高了28.51%(P<0.01)。在45 ℃时，经UV-C辐照后酶活由30.10 U/g上升为34.74 U/g，提高了15.42%(P<0.05)。在55 ℃时，经UV-C辐照后酶活力由26.92 U/g上升为29.55 U/g，提高了9.77%(P<0.05)。结果表明UV-C辐照对多酚氧化酶最适pH和温度没有明显影响，对酶活力有显著激活作用。

图8 pH对UV-C辐照前后多酚氧化酶酶活影响Fig.8 Effect of pH on the activity of the endogenous polyphenol oxidase in shrimp head before and after UV-C irradiation

图9 温度对UV-C辐照前后多酚氧化酶酶活影响Fig.9 Effect of temperature on the activity of the endogenous polyphenol oxidase in shrimp head before and after UV-C irradiation

3 结论

(1)UV-C辐照前后虾头酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和多酚氧化酶的最适pH和温度的酶学特性无明显变化，对脂肪酶和几丁质酶的最适pH有所改变，对各种内源酶的最适温度均无显著影响。UV-C辐照后，内源酸性蛋白酶最适为pH 3，温度60 ℃左右；内源碱性蛋白酶的最适pH 8，温度50 ℃左右；内源几丁质酶最适pH由5变为6左右，温度40 ℃左右；内源脂肪酶最适pH由10变为6～10，温度40 ℃左右；内源多酚氧化酶最适pH 8，温度为25 ℃左右。

(2)在30 W、20 cm高度、UV-C辐照20 min的最适条件下，UV-C辐照后内源酶酶活提高，酸性蛋白酶酶活由329.81 U/g上升为408.93 U/g，提高了23.99%；碱性蛋白酶由2 253.45 U/g上升为3 098.24 U/g，提高了37.49%；脂肪酶由5.24 U/g上升为6.36 U/g，提高了21.37%；几丁质酶由3.74 U/g上升为5.15 U/g，提高了37.70%；多酚氧化酶由47.29 U/g上升为69.29 U/g，提高了46.52%。

(3)UV-C辐照对凡纳滨对虾虾头主要内源酶均有显著的激活作用，但其激活机制有待进一步深入研究。