昆虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质表征

叶文琪，薛岚，王超，崔文璟，周哲敏，刘中美

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

β-丙氨酸(3-氨基丙酸)广泛应用于医药、食品、化工等领域，目前主要是以丙烯腈或β-氨基丙腈为底物通过化学合成[1-2]。随着环境问题日益引起人们的关注，传统的化学方法将逐渐被生物方法所取代，如酶转化法、全细胞催化法和发酵法[3-4]。

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(EC4.1.1.11 ADC)是催化L-天冬氨酸产生β-丙氨酸的关键酶，近几十年来受到广泛的关注。细菌来源的ADC研究较多，包括来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌的ADC等[5-8]。1979年，WILLIAMSON和BROWN首次从大肠杆菌中分离出ADC[9]，随后RAMJEE等[10]对该酶进行酶学性质表征，其Km和kcat分别被确定为0.151 mm和0.57 s-1。谷氨酸棒杆菌来源的ADC比酶活为2.7 μmol/(min·mg)[11]。结核分枝杆菌来源的ADC经过量表达、纯化后，测得动力学参数Km和kcal分别为0.219 mm和0.65 s-1。，比酶活为2.1 μmol/(min·mg)[12]。

谷氨酸棒杆菌来源的ADC稳定性好、酶活较高，具有工业应用潜力。用谷氨酸棒杆菌来源的ADC纯酶合成β-丙氨酸，产量可达到12.85 g/L[13]；过表达谷氨酸棒杆菌来源的ADC并设计代谢途径，β-丙氨酸合成量达到32.3 g/L[14]；去年，LI等[15]构建了过量表达谷氨酸棒杆菌ADC的大肠杆菌重组菌，实施全细胞催化生产β-丙氨酸，产量达到24.8 g/L。

众多的研究表明，微生物来源ADC的酶活力很低，使得β-丙氨酸的生物合成法受到限制。有研究表明，昆虫来源ADC的酶活力远高于细菌来源ADC[16-18]。在前期研究中，将红粉甲虫(又名赤拟谷盗，Triboliumcastaneum)来源的ADC在大肠杆菌中重组表达，重组酶的比酶活是细菌来源的2倍左右[19]。对其进行分子改造，初筛结果显示突变体K49R稳定性与酶活力较野生型有一定的优势[20]。本研究旨在实现β-丙氨酸“绿色生产”，筛选催化能力优良的突变体、并进行酶学性质表征，建立全细胞催化策略，优化重组菌株合成β-丙氨酸的催化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

重组表达载体pEt-28a(+)-TcADC、pEt-28a(+)-TcADC/K49R为本实验室早期构建，宿主菌E.coliBL21(DE3)为实验室保藏。种子培养基为LB培养基，诱导培养基为2YT培养基。L-天冬氨酸钠、β-丙氨酸、IPTG、卡那霉素购于上海生工生物工程有限公司;酵母提取物、蛋白胨购于Oxford公司；异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)购于Sigma公司。

1.2 主要仪器设备

蛋白纯化仪和纯化柱，GE Healthcare UK Ltd。

2 实验方法

2.1 酶的过量表达与纯化

将重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcADC、BL21/pET28a-TcADC/K49R的单克隆接种于5 mL LB培养基(含有50 μg/mL卡那霉素)中，置于37 ℃、200 r/min的摇床中，过夜振荡培养，进行菌种活化。按2%(体积分数)接种量接种于含有50 μg/mL卡那霉素的 2YT培养基中，37 ℃、200 r/min，振荡培养至OD600为0.6～0.8。加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，在20℃条件下诱导表达20 h左右。

利用Purifier AKTA蛋白纯化仪和His Trap HP纯化柱对目的蛋白进行分离纯化。收集细胞培养液，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，收集沉淀。用Binding缓冲液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)悬浮细胞，置于冰上进行超声波破碎。溶液澄清之后，于4 ℃、12 000 r/min离心45 min，收集细胞破碎上清液。用Binding缓冲液，将0.45 μm滤膜过滤后的粗酶液上样，用Binding缓冲液洗去非结合蛋白。用15个柱体积的Elution缓冲液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)进行线性洗脱，收集洗脱峰。放入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，4 ℃，过夜透析除去咪唑。利用12%(质量浓度)的SDS-PAGE对分离纯化样品进行电泳检测，利用Brandford法测定目的蛋白浓度。

2.2 L-天冬氨酸和β-丙氨酸检测

L-天冬氨酸和β-丙氨酸采用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法检测[19-20]。氨基酸的衍生产物采用HPLC测定，色谱柱为La Chrom C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A溶液80%(体积分数)乙腈水溶液，B溶液97∶3(体积分数，pH 6.5)的0.1 mol/L乙酸钠-乙腈溶液；梯度洗脱：0～20 min，B溶液由95%下降至65%；20～30 min，B溶液由65%上升至95%；30～43 min，B溶液梯度保持不变，检测波长为254 nm，柱温为40 ℃。

2.3 酶学性质测定

最适温度测定。将pH 6.5的反应液(含200 μg/mL纯酶液，100 mmol/LL-天冬氨酸钠，1 mmol/L PLP)置于不同温度的水浴(30、37、40、42、50、55 ℃)中反应10 min，测定酶活。将最高酶活定义为100%，分析酶的最适反应温度。

温度稳定性测定。将500 μg/mL纯酶液置于不同温度(30、37、40、42、50、55 ℃)孵育30 min后，于冰上冷却5 min。加入终浓度100 mmol/LL-天冬氨酸钠和1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5条件下反应10 min测定残余酶活。将初始酶活定义为100%，分析温度稳定性情况。

最适pH测定。配置不同pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0的反应液(含200 μg/mL纯酶液，100 mmol/LL-天冬氨酸钠，1mmol/L PLP)，于37 ℃反应10 min测定酶活性。将最高酶活定义为100%，分析酶的最适反应pH。

pH稳定性测定。将500 μg/mL纯酶液置于不同pH缓冲液(pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)中，于冰上过夜孵育。加入终浓度100 mmol/LL-天冬氨酸钠和1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5条件下反应10 min测定残余酶活。将初始酶活定义为100%，分析pH稳定性情况。

动力学常数测定。在终浓度50 μg/mL纯酶液中，分别加入终浓度5～100 mmol/LL-天冬氨酸钠、终浓度1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5条件下，反应10 min检测β-丙氨酸产量，测定初始反应速率。采用GraphPad Prism软件拟合曲线，测定动力学常数Km，kcat。

将在37 ℃，pH 6.5的条件下，每小时转化L-天冬氨酸钠生成1 mmolβ-丙氨酸所需酶量定义为一个酶活力单位U。

2.4 全细胞催化合成β-丙氨酸的体系优化

以提高重组菌株的蛋白表达量及生物量为目的，在培养基中添加10和20 g/L葡萄糖，重组菌株经0.2 mmol/L IPTG，20 ℃诱导20 h后，冰浴破碎，利用质量浓度为12%的SDS-PAGE对重组酶的表达情况进行电泳检测。

重组菌细胞经培养诱导后，离心收集，浓缩到OD600=200。在10 mL反应液(pH 6.5)中，加入L-天冬氨酸钠固体粉末至终浓度1 mol/L，1 mmol/L PLP，反应温度为37 ℃，持续搅拌。每隔2 h取样测定L-天冬氨酸剩余量和β-丙氨酸的生成量。同时将不添加PLP的实验样品作为对照组。

3 结果

3.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的表达与纯化

酶活与热稳定性初步筛选结果显示，红粉甲虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶(TcADC)突变体K49R催化性能优良。本研究将其过量表达并分离纯化。分离纯化结果如图1所示，重组菌成功表达了野生型与突变体L-天冬氨酸-β-脱羧酶，且获得了电泳纯目的蛋白，分子量约为61 kDa。

图1 重组酶过量表达与纯化Fig.1 Overexpression and purification of recombinant enzymes

3.2 突变体K49R的酶学性质表征

由图2-a可知，野生型的最适温度为37 ℃，突变体K49R的最适温度为42 ℃。在不同温度下处理酶30 min后测量其热稳定性,发现随着温度升高，野生型的酶活性降低，特别是在高于40 ℃时(图2-b)。在40 ℃处理后，野生型的活性保持在70%，而在50 ℃处理情况下，野生型仅剩余22%的酶活；而突变体K49R稳定性有所提高，50 ℃处理后仍剩余34%的酶活(图2-b)。

野生型与突变体K49R的最适pH均为6.5(图2-c)。在冰上在各种pH条件下孵育8 h后检测其pH稳定性，突变体K49R与野生型几乎无差异：在pH 6.0～7.0之间保持稳定，在pH低于5.5或高于7.5时，TcADC的剩余酶活低于75%(图2-d)。

a-最适温度;b-温度稳定性;c-最适pH;d-pH稳定性图2 温度与pH对酶活力的影响Fig.2 Effects of temperature and pH on enzymatic activity

测定突变体K49R的比活性和动力学参数(表1)并与野生型进行比较。野生型的比活性为290±9.5 U/g，Km为5.63±0.36 mmol/L，kcat为16.9±0.6 s-1。突变体K49R的Km值有大幅下降，表明其底物亲和力优于野生型；虽然kcat值略有下降，但是催化效率还是有显著提升，是野生型的1.8倍。

表1 动力学参数与比酶活Table 1 Kinetic parameters and specific activities

3.3 全细胞催化合成β-丙氨酸

3.3.1 重组ADC表达条件的优化

以提高重组菌株的蛋白表达量及生物量为目的，在培养基中添加葡萄糖。培养、诱导表达后，蛋白表达情况如图3所示。添加10 g/L葡萄糖后，蛋白表达量有所增加，可溶性与沉淀中的蛋白量都随之增加。与添加20 g/L葡萄糖和未添加葡萄糖相比，添加量为10 g/L时，相同生物量的菌体内可溶性蛋白含量较高。另外，添加葡萄糖后，其生物量也从OD6005.8提高到8.8。

图3 葡萄糖对重组ADC的影响Fig.3 Effect of glucose on the expression of TcADC

3.3.2 PLP对全细胞催化反应的影响

TcADC为PLP依赖型酶，通过一次性加入高浓度底物的方法研究PLP对全细胞催化反应的影响。在含有重组大肠杆菌细胞(OD600=200)的反应液中，添加1 mol/L的L-天冬氨酸进行全细胞催化反应，定时取样监测的底物与产物的含量。结果如图3所示，添加1 mmol/L PLP的反应体系较快地完成了催化(图4-b)，而未添加PLP的反应体系也能完成催化，但是生产效率较低(图4-a)。重组菌细胞内的PLP作为辅酶参与全细胞催化，而额外添加PLP可以大幅提高β-丙氨酸生产效率。添加2 mmol/L的PLP或每隔10 h添加1 mmol/L的PLP，催化效率几乎与添加1 mmol/L的PLP相同(数据未显示)，表明在本全细胞催化体系中，一次性添加1 mmol/L的PLP可以满足辅酶的供应需求。

a-未添加PLP;b-添加1 mmol/L PLP图4 PLP对全细胞催化合成β-丙氨酸的影响Fig.4 Effect of PLP on β-alanine synthesis using whole-cell catalysis

4 结论

目前，由于ADC的催化能力有限，限制了工业上生物合成法生产β-丙氨酸。本研究对红粉甲虫L-天冬氨酸-β-脱羧酶的突变体K49R进行了酶学性质解析，发现其热稳定性较野生型有所提高，最适pH和pH稳定性与野生型相差无几。酶动力学测定结果显示其催化效率是野生型的1.8倍，推测是得益于其大幅提高底物亲和力。突变体K49R具有更优良的催化性能以及很大的工业应用潜力。全细胞催化合成β-丙氨酸体系优化结果显示，添加10 g/L葡萄糖可以将重组菌生物量提高0.5倍，重组酶的表达量也相应提升；添加适量PLP可以大幅缩短催化时间，提高β-丙氨酸的合成效率。