反基因锁核酸在转基因小鼠体内抗乙肝病毒的短期效果

肖树荣邓益斌许桂丹彭彬农顺强胡仁统黄晶晶韦家柱陈晓昊

(1. 右江民族医学院附属医院医学检验中心，广西 百色 533000；2. 广西肝胆疾病临床医学研究中心，广西 百色 533000；3. 广东省阳江市人民医院检验科，广东 阳江 529500；4. 广西百色市妇幼保健院保健科，广西 百色 533000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已严重危害全球人类健康，其导致的慢性乙型肝炎呈流行性趋势，长期持续性感染极易发展为肝硬化及肝癌[1-2]。目前临床上抗HBV药物虽多，但仍缺乏较理想效果的药物。其中核苷(酸)类似物通过作用于逆转录酶抑制病毒复制，短期内具有抗病毒迅速、副作用较少等优点[3-4]，但长期用药会引起变异耐药、肾脏等重要脏器损伤使治疗无法达到满意效果[5-6]。根据反基因治疗的基本原理，主要就HBV编码链设计特定的外源寡聚脱氧核苷酸片段，通过其与病毒双链 DNA 的特定区域专一性结合，形成三链DNA 分子结构，达到阻断靶基因的复制与转录，以期实现抑制病毒基因表达的目的[7]。课题组大量的前期研究结果显示反基因治疗能有效抑制HBV的复制与表达[8-12]，为了更深入探讨反基因锁核酸(anti-gene-locked nucleic acid，anti-gene，LNA)最优抗病毒效果，特别针对HBV C编码链设计反基因LNA，通过阳离子聚合物包裹反基因LNA进行转染，经小鼠尾静脉注射将反基因LNA导入肝细胞核内，同时与拉米夫定(lamivudine，LAM)比较其在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果，以期发现较有效的抗病毒药物。

1 材料与方法

1.1材料 HBV转基因小鼠15只，其中雌性8只，体重20～26 g；雄性7只，体重25～33 g，购自中国人民解放军南部战区空军医院，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2017-0016；阳离子聚合物转染试剂(in vivo-jetPEI )为Polyplus公司(CPT201vQ)；反基因LNA由上海生工合成(111231052)；拉米夫定片购于葛兰素史克制药(苏州)有限公司(H20030581)；HBsAg定量检测试剂盒购于郑州安图生物工程有限公司(20190612)；HBV DNA定量测定试剂盒购于湖南圣湘生物科技有限公司(20153400083)。

1.2方法

1.2.1设计、筛选与合成反基因LNA片段 从NCBI/Genome数据库中获取ayw型HBV全基因序列(U95551.1;GI:2182117)，根据反基因寡核苷酸的作用原理，针对HBV C编码链利用RNA structure软件就2404～2418nt位点设计反基因锁核酸片段，依据Walk(步移)功能选择自由能值较小的片段：5’-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3’，*代表修饰位置，经同源性分析序列，送上海生工合成和纯化。

1.2.2阳离子聚合物包裹反基因LNA形成复合物 依据阳离子聚合物能包裹反基因LNA浓度范围筛选试验结果，选择最佳药物剂量，以每克HBV转基因小鼠体重量注射0.5 μg的反基因LNA；将10%葡萄糖(GLU)反基因LNA混合液的稀释至终浓度为5%葡萄糖反基因LNA混合液200 μl；阳离子聚合物的量与反基因LNA的量配(按阳离子聚合物的试剂说明书计算)，将10%葡萄糖阳离子聚合物稀释至终浓度为5%葡萄糖阳离子聚合物溶液200 μl；将两者温和混匀并置室温10 min备用。

1.2.3对HBV转基因小鼠进行体内实验 将15只HBV转基因小鼠随机分为3组(n=5)，分别为对照组(雌性3只和雄性2只)、拉米夫定灌胃组(雌性2只和雄性3只)、反基因LNA组(雌性3只和雄性2只)。对照组和反基因LNA组于1 d、3 d、5 d经尾静脉分别注射5%GLU-阳离子聚合物的混合物400 μl和注射5%GLU-阳离子聚合物-反基因LNA的混合物400 μl。同时将拉米夫定组按2 mg/kg最佳剂量灌胃小鼠2次/天，连续用药7 d。分别在给药前和后1 d、3 d、5 d、7 d用微量吸管经小鼠眼眶静脉采血，放置室温30 min，经离心机12000 r/min离心15 min，将分离好的血清收集置无菌EP管中，贮存于-20℃冰箱备用。给药后第10 d将小鼠温和处死取肝、肾包埋并置-80℃保存。

1.2.6判断HBV转基因小鼠肝脏组织的HBsAg含量 将包埋好的小鼠肝脏进行快速切片，根据免疫组织化学法操作，并进行DAB染色，苏木素复染，具体按试剂盒说明书操作。置荧光显微镜下观察肝组织中HBsAg的着色情况，按一定顺序计数200个细胞，计算HBsAg细胞阳性率=(阳性细胞数/200)×100%，以判断反基因LNA对肝细胞内HBsAg的抑制作用。

1.2.7检测HBV转基因小鼠血清中肝、肾及心脏功能 根据生化分析法，严格按照全自动生化分析仪SOP文件进行操作，做好各项目质量控制，确保实验室在控后对小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine Amiotransferase，ALT)、白蛋白(albumin，Alb)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Crea)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)等肝、肾和心功能指标进行检测，判别阳离子聚合物-LNA混合物对小鼠各主要脏器功能的影响。检测试剂盒ALT购于四川新健康成生物公司(0719061)、Alb购于迈瑞生物(148318002)、BUN购于上海执诚生物(R7543)、Crea购于上海执诚生物(CR7541)、CK购于迈克生物(0319011)。

1.2.8镜下观察HBV转基因小鼠肝脏和肾脏组织结构改变 根据HE染色技术，小鼠肝脏和肾脏组织包埋和切片后，通过苏木素及伊红染色，玻片自然干燥后，置电子显微镜下观察，判别小鼠肝脏和肾脏组织结构改变的情况，判定阳离子聚合物-LNA混合物对小鼠主要脏器结构的影响。

2 结果

2.1反基因LNA与拉米夫定对HBV 合成HBsAg的影响 与给药前相比，拉米夫定组对HBV 合成HBsAg合成有一定的抑制作用(P<0.05)，而反基因LNA组则表现出较明显的抑制作用(P<0.05)；第3 d、5 d、7 d与对照组相比，拉米夫定组对HBsAg合成的抑制作用尚不明显(P>0.05)，而反基因LNA组则表现出较强的抑制作用(P<0.05)；给药后的第1 d、3 d、5 d、7 d，反基因LNA组血清HBsAg的平均抑制率分别为20.37%、36.01%、44.73%、47.44%；拉米夫定组血清HBsAg的平均抑制率分别为2.17%、4.32%、5.40%、7.71%；见表1、表2。免疫组织化学结果显示，与对照组HBsAg阳性细胞率(89.10±2.90)%相比，反基因LNA组肝组织中HBsAg阳性细胞率(39.3±4.90)%，P<0.05；而拉米夫定组(80.50±3.40)%，P>0.05，见图1。

2.2反基因LNA与拉米夫定对HBV DNA的抑制效果 与给药前相比，拉米夫定组对HBV DNA复制有一定的抑制效果(P<0.05)，而反基因LNA组则表现出较明显的抑制效果(P<0.05)；第3 d、5 d、7 d与对照组相比，拉米夫定组对HBV DNA复制的抑制效果尚不明显(P>0.05)，而反基因LNA组则表现出较强的抑制效果(P<0.05)；给药后第1 d、3 d、5 d、7 d，HBV DNA的抑制率与给药前相比，反基因LNA组的平均抑制率分别为19.45%、44.37%、51.33%、52.64%，拉米夫定组分别为2.54%、4.04%、5.84%、9.39%；见表3、表4。

表1 反基因LNA与拉米夫定对HBV合成HBsAg的影响

注：与对照组比较，a：P<0.05； 与拉米夫定组比较，b：P<0.05；与给药前比较，c：P<0.05

表2 反基因LNA与拉米夫定对HBV合成HBsAg的抑制率

表3 反基因LNA与拉米夫定对HBV DNA复制的影响

注：与对照组比较，a：P<0.05； 与拉米夫定组比较，b：P<0.05；与给药前比较，c：P<0.05

表4 反基因LNA与拉米夫定对HBV DNA的抑制率

2.4反基因LNA对肝、肾及心功能的影响 HE切片染色观察到各组转基因小鼠肝脏、肾组织结构无明显改变，见图2、图3。检测反基因LNA组血清ALT、Alb、BUN、Crea、CK等肝、肾和心功能指标，与对照组相比(P>0.05)，差异无统计学意义，见表5。说明反基因LNA对小鼠的肝肾心功能及其组织结构无明显影响。

图1 各组肝脏组织中含HBsAg细胞的分布特点(免疫组化×200倍，

注：A：对照组；B：拉米夫定组；C：反基LNA组；D：拉米夫定组与对照组比较，#P>0.05；反基因LNA组与对照组比较，*P<0.05

图2 各组肝脏切片组织结构镜下形态学(HE 染色×200倍)

图3 各组肾脏切片组织结构镜下形态学(HE 染色×200倍)

表5 反基因LNA对肝肾心功能的影响

注：反基因LNA组的丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、血尿素氮、肌酐、肌酸激酶与对照组比较

3 讨论

当前乙型肝炎抗病毒治疗的目的在于稳定抑制病毒复制来防止HBV引起的相关并发症，如肝硬化和原发性肝癌。目前使用的核苷或核苷类似物恩替卡韦和替诺福韦酯的主要作用机制是通过靶向抑制病毒DNA聚合酶活性发挥抗病毒作用，虽然有较低的风险，但是需长期持续用药，药物抵抗常发生在病人抗病毒治疗期间，其原因主要是由于HBV缺乏校对阅读功能，导致乙肝病人患者体内大量病毒发生突变。特别在宿主免疫清除和抗病毒药物作用下，更容易发生选择性逃避突变和强烈影响感染病人体内主要HBV准种。

HBV是由3.2 kb组成具有包膜的部分双链松弛环状的DNA病毒，常被分为A-J 共10种基因型，各基因型之间的全基因组序列差异性>8%。基因组结构基本相似，包括S区、C区、P区和 X 区4个开放读码区(open reading frame，ORF)，其中C区十分保守区，是基因治疗的理想靶位。C区C基因是病毒装配、成熟和分泌过程中重要的靶点。从而抑制病毒C基因表达，有可能降低HBV抗原的合成和抑制病毒的复制。未修饰的反基因序列因受到体内复杂环境影响，在与靶点特异性结合前可能已被完全降解。为了增强反基因LNA序列能抵抗核酸酶降解能力及热稳定性[13]，提高其与HBV结合的亲和力[14- 16]，我们对反基因LNA片段进行修饰和纯化。

依据反基因治疗的作用机制，我们针对HBV C基因同聚嘌呤区2404～2418nt位点设计合成反基因LNA分子，与HBV C双链 DNA 的特异性结合，形成稳定的三链 DNA 分子结构，以阳离子聚合物为载体经尾静脉注射转染HBV转基因小鼠，在肝内靶向结合病毒基因以达到封闭其表达的目的。静脉注射给药后第7 d结果显示，反基因LNA组HBV DNA和HBsAg平均抑制率为52.64%和47.44%，明显高于拉米夫定组的9.39%和7.71%，对HBV基因表达和肝细胞HBsAg合成有明显的抑制作用。揭露了针对HBV C基因同聚嘌呤区设计合成的反基因LNA分子在体内可阻断HBV复制和转录及抑制基因的表达。此外，未发现反基因LNA对HBV转基因小鼠的肝、肾及心功能的检测指标和肝、肾组织结构有明显改变。实验结果显示，拉米夫定短期内抗病毒效果不理想，其原因是拉米夫定主要作用于HBV转录阶段抑制酶的合成及蛋白表达，从而控制病毒的进展，需要长期规律用药且易发生耐药性突变。

因此，本研究主要针对HBV C基因同聚嘌呤区2404～2418nt位点设计合成的反基因LNA分子，在体内可阻断HBV复制和转录及抑制基因的表达，为HBV提供有效的靶向性治疗，以期找到有效的抗病毒反基因药物分子，从而实现短期治疗就能较好控制HBV感染者的可能，同时为反基因治疗垫定一定的理论和实验基础。