细菌外膜囊泡发生机制及其影响因素的研究进展
2019-12-103杨红亚
3杨红亚
(1. 内江卫生与健康职业学院基础医学部,四川 内江 641100;2. 成都中医药大学基础医学院,四川 成都 610075;3. 遵义医药高等专科学校中医系,贵州 遵义 563002)
外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMV)是由革兰氏阴性菌释放的一种特定的生理结构,其为纳米级大小、球形、双层膜包裹的,内含生物活性蛋白、脂质、核酸和代谢物的囊泡状结构。几乎所有的革兰氏阴性细菌均能产生外膜囊泡[1-2],但物种的多样性使它们在包膜结构和组成上存在一定的差异[3-4]。OMV的释放可去除细菌细胞内不必要的物质,同时也是细菌抵御外界应激压力的一种手段,这对细菌的存活至关重要。OMV的脱落被认为是细胞间通讯的一种普遍机制,通过OMV释放将其携带的内容物递送到其他细菌或真核细胞中,从而在细胞相互作用中发挥多种关键作用,如营养摄取、抗菌防御、水平基因转移、生物膜形成以及毒力因子递送等[1,5-6]。OMV作为免疫刺激剂被认为是一种有前景的疫苗成分,近年来OMV相关疫苗的开发受到广泛的关注[1,7-8]。细菌正常生长和受应激时,都会释放OMV,但其发生机制目前尚不清楚。了解OMV的生物发生机制及其影响因素,对充分认识OMV在细菌生理学、致病机制及相关疫苗研发中具有重要意义。
1 OMV生物发生机制模型的提出
目前,关于OMV的生物发生机制研究主要集中于以下几种模型。
1.1外膜与肽聚糖间交联的减少 革兰氏阴性细菌的细胞壁由外膜(OM)和肽聚糖(PG)组成,周质间隙位于细胞膜(内膜)和外膜间,周质间隙内的一薄层肽聚糖连接内外两层膜。Lpp是含量丰富的外膜脂蛋白,共价交联OM和PG层,维持包膜结构的完整性。当PG分解-合成平衡改变时,局部Lpp-PG交联被破坏,外膜的一小部分向外凸出,导致囊泡的产生[9-10]。Schwechheimer C等[9]发现OMV的产生受PG重塑和Lpp-PG交联的调节,且 OMV的产生水平与Lpp-PG交联呈反比关系。大肠杆菌nlpI突变体在产生高水平OMV时,共价OM-PG交联率明显降低(P<0.05)[10]。这些观察均支持一个模型,即OMV在OM-PG交联水平局部降低的位点出芽。
1.2周质间隙中错误折叠蛋白或包膜成分的累积 Schwechheimer C等[9]同时也发现OMV产生并不完全取决于Lpp-PG交联。在一些高囊泡性菌株中,OMV产生与Lpp-PG交联之间并不呈反比关系,而在细菌周质间隙中出现错误折叠蛋白或包膜成分的积累,他们推测囊泡的产生是由这些材料的累积引起的[9]。这些物质积聚在周质间隙的某些区域后,将外膜向外挤出而出芽,从而去除不需要的细胞成分。
1.3脂质A修饰引起的LPS重塑 革兰氏阴性细菌的OM双层脂质组织为独特的不对称结构,内部小叶和外部小叶分别由甘油磷脂(PL)和LPS构成,脂质A是LPS生物活性的主要组分[11]。Wael E等[12]发现脂质A脱酰酶PagL的表达引起囊泡增多,而PagL突变株的OMV合成减少,且较之OM,仅OMV中出现脱酰脂质A的积累。Bonnington KE等[13]发现激活PhoP/Q-和PmrA/B系统,同时诱导向OM添加修饰的LPS物种后,OMV产量增加,且直径增大[13]。OM中具有共价修饰的脂质A物种被保留,而棕榈酰化脂质A物种选择性丧失[13]。这些证据表明OMV生物发生的机制涉及脂质A修饰引起外膜重塑,导致外膜弯曲和随后的OMV形成。
1.4内部或外部小叶脂质的富集 Koldsø H等[14]提出脂质聚集与膜曲率相关,特定脂质的聚集会导致OM双层表面的局部弯曲。球体的曲率为半径的倒数,细菌若要形成高度弯曲的OMV,其不对称OM小叶的曲率必须增大很多倍。基于此,Gui MJ等[15]提出细菌形成OMV,必须在OMV的内部和外部小叶之间,形成具有较大差异的脂质的量或类型,并证明这能通过上调内/外部单侧小叶脂质的产生来实现。OM外表面选择性富集具有适应曲率能力的A-LPS和CTD-家族蛋白,A-LPS的去酰化进一步增加曲率,导致OM局部向外弯曲形成OMV[15]。内部或外部小叶脂质的富集,可能导致单层区域的不对称,从而增加整个双层的固有曲率,导致膜弯曲。
1.5其他模型 除上述模型外,有关 OMV生物发生还提出了以下几种模型:①假单胞菌喹诺酮信号(PQS)的膜分布调节模型。Florez C等[16]发现铜绿假单胞菌PQS输出与OMV产量密切相关,同时还检测到OMV释放少的菌株隔离了内膜中大部分PQS。这表明OMV形成与PQS信号输出有关,PQS嵌入外膜导致外部小叶扩张,由此引起曲率并最终形成OMV[16]。②磷脂(PL)在OM外部小叶的累积产生OMV。Roier S等[17]报道VacJ/Yrb ABC转运系统(一种拟议的PL转运蛋白)参与了OMV的生物发生。PL转运蛋白突变体的OMV中富含PL[17]。磷脂在OM外部小叶中不对称扩张引起OM向外膨胀,导致OMV的产生。③Hampton CM等[18]发现创伤弧菌OMV是以与荚膜多糖(CPS)相关的空间差异方式产生。他们观察到野生型创伤弧菌OMV在细胞周围形成一系列平面同心环,并与膜保持约200 nm的间距,透射电子显微镜显示OMV边缘有厚约100 nm的荚膜存在,SPRF进一步揭示多糖链之间端对端相互作用,维持细胞-细胞、细胞-OMV以及OMV-OMV之间观察到的200 nm间距[18]。
2 影响OMV生物发生的因素
OMV的产生并不是膜简单剪切的物理过程,而是一种将生物分子分选到OMV中的能量消耗过程[15]。尽管OMV生物发生的分子机制还不是非常清楚,但已有大量的证据表明,OMV的生物发生受到细菌生长条件和遗传因素的影响。
2.1生长条件 细菌OMV的产生是一种受环境控制的特定的分泌过程。物理刺激如高温、渗透压等,生化刺激如抗生素、环氧化物等,以及限制生长所需的营养元素如氧气、氨基酸等,均会对OMV的生成产生一定的影响[3]。抗生素对OMV产生的影响涉及产量、尺寸、毒力因子及蛋白成分等多方面[19-20]。反过来,OMV通过这些改变在抗生素应激下对细菌起到防御保护作用。Chan KW等[22]发现铁离子限制下,OMV蛋白质组显著变化。有研究表明外膜囊泡在铁离子限制条件下可充当铁供体[23]。这也揭示了囊泡在铁获取中的重要作用,这对于宿主的存活是至关重要的。值得注意的是,细菌产生OMV并不限于特定的生长条件,在宿主体内也会产生;也并非受应激才生成,即使在没有外部应力的情况下,OMV也要释放。
2.2遗传因素 OMV的生成和内容物的选择受基因调控,并不是随机发生或细胞死亡的结果。在大肠杆菌OMV表型的转座子突变体筛选中,发现nlpA突变体比野生型产生更少的OMV,而nlpI突变体产生更多的OMV[10]。virK基因突变导致志贺氏菌OMV的温度依赖性过量产生[24]。fumA和tktA突变导致土拉弗朗西斯菌OMV产生的严重缺陷[25]。这些研究均表明OMV生物发生可以在遗传水平上进行调控。
3 小结
OMV生物发生影响因素的研究,提示外膜囊泡对细菌存活的重要作用。关于目前OMV生物发生的模型,需作出以下几点说明:首先,每种模型都是在对一种或几种细菌OMV研究的基础上提出的,此细菌物种成立的模型并不一定适用于彼物种,正如荚膜多糖调控OMV生物发生的机制,目前为止仅在创伤弧菌野生型菌株中观察到;其次,同一细菌OMV的生物发生可能不止对应一种模型,可能存在OMV生物发生的多种途径;最后,现有的发生模型未能涵盖全部革兰氏阴性菌OMV的生物发生机制,还有待进一步的研究和深入。
OMV的纳米级大小、坚固双层结构以及远距离递送活性分子等特点,赋予了它被用于疫苗开发的可能。大量证据表明OMV作为针对广泛细菌感染的疫苗,具有很大的潜力[1,8]。然而,对OMV生物发生认识的不足限制了对它的大规模生产,且病原体衍生的OMV的过度毒性阻碍了它们的临床应用。因此,许多研究专注于囊泡工程化设计,以便OMV能更好地递送药物和抗原,从而改进目前的抗菌药物治疗方法。总之,革兰氏阴性菌OMV生物的发生,关系到未来新抗生素或基于OMV的疫苗开发。揭示OMV生物发生的机制,将促进OMV生物工程在生物技术和生物医学中的应用。关于OMV的形成及其产生水平和内容物选择间关系等,虽然还存在诸多问题,但进一步探索具有良好特征的模型系统,可能会在未来有所见解。