氟化标记结合氟固相萃取分析血清中的N-聚糖

冯 秒， 熊思元， 林亚维*

(1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉 430070;2.武汉市洪山区疾病预防控制中心，湖北武汉 430064)

重要生物疾病标记物N-聚糖是一种重要的疾病标志物，它和癌症、炎症、心血管疾病、先天性疾病等多种疾病有关[1 - 4]，其分析检测对于疾病的诊断与病理研究具有重要意义。目前聚糖的分析检测在生物研究、临床诊断、生物制药方面得到了广泛关注[5 - 6]。然而N-聚糖本身结构复杂、离子化效率低、不含生色基团[7 - 9]，而复杂生物样品中聚糖丰度较低，因此对于复杂生物基质中N-聚糖进行高灵敏度、高选择性分离分析仍是一项艰巨的挑战。目前N-聚糖主要检测手段包括毛细管电泳法、核磁共振法、高效液相色谱法和质谱法[10 - 12]。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)以其灵敏度高、步骤简单、易于操作、分析通量大，以及分析速度快等优势成为检测聚糖的主要方法之一[13 - 15]。该方法首先利用特异性酶如N-糖酰胺酶F(PNGase F)切断糖蛋白上的酰胺键释放糖链，其次将聚糖与标记试剂衍生化标记，纯化，最后进行质谱检测。常规的N-聚糖的固相萃取(SPE)纯化方法主要依赖于极性，如PGC是通过聚糖的极性实现分离[16]，然而可能导致生物样品中亲水性杂质的共洗脱，干扰其质谱检测。

本文采用一种新型SPE纯化方法，即氟固相萃取(F-SPE)。采用“一管式”分析方法实现N-聚糖提纯与富集。利用含氟试剂2-氨氧基-N-(3-全氟己基)-乙酰胺(PFHA)对N-聚糖还原端进行标记，增强其疏水性和离子化效率；对标记后的N-聚糖与含氟材料之间进行F-SPE，去除样品中蛋白、无机盐等杂质，实现衍生化N-聚糖的富集与提纯，最终达到MALDI-TOF MS的高灵敏度、高选择性检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

MALDI-TOF/TOF 5800质谱仪(美国，SCIEX公司)；HH-1恒温水浴箱(国华电器有限公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；5415D高速离心机(Eppendorf公司(中国))；TW50SPE-12S固相萃取装置(北京东方)。

麦芽七糖(DP7)、核糖核酸酶B(RNase B)、牛血清白蛋白(BSA)、三氟乙酸均购自美国Sigma公司；2-氨氧基-N-(3-全氟己基)-乙酰胺(PFHA)(美国Fluorous Technologies公司)；冰HAc(上海凌峰化学试剂有限公司)；乙腈(美国Fisher公司)；2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、肽N-糖酰胺酶F(PNGase F)、甲醇、NH4HCO3(Aladdin(中国)公司)；壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、十二烷基硫酸钠(SDS)、10X、β-株蛋白生成障碍性贫血洗脱缓冲试剂包(G7缓冲液)均购自美国BioLabs公司；NaCl(国药集团化学试剂有限公司)。所用试剂无特殊说明均为分析纯。实验用水为超纯水。

人血清样品由武汉同济医学院协和医院提供。

1.2 实验步骤

1.2.1 PFHA与DP7的衍生在12.5 μL 10 μmol/L DP7溶液中，依次加入25 μL 2.0 mmol/L PFHA溶液、12.5 μL 0.5%HAc溶液，75 ℃下反应2 h得到衍生化DP7溶液，待MALDI-TOF MS分析。

1.2.2 RNase B中N-聚糖的标记(1)RNase B的酶解：向10 μL 1 mg/mL标准糖蛋白RNase B溶液中，依次加入50 μL 50 mmol/L NH4HCO3缓冲液溶液，2.4 μL SDS变性缓冲液，混匀后，于100 ℃下反应10 min。冷却至室温后，加入12 μL 10% NP-40溶液，静置30 min后加入1.0 μL PNGase F溶液，于37 ℃下酶解18 h，煮沸5 min以终止反应。所得溶液经混旋、离心干燥后，溶于100 μL超纯水中。(2)N-聚糖与PFHA衍生：取0.1 μg酶切产物溶液，依次加入10 μL 4 mmol/L PFHA溶液，5 μL 10% HAc溶液，75 ℃下反应2 h得到衍生化溶液。(3)F-SPE萃取：依次用50 μL甲醇预洗氟化柱3次(内填有镶嵌硅胶的氟化碳材料)，50 μL 30%甲醇/水溶液平衡液润洗氟化柱5次；将所得的衍生化溶液混旋，离心干燥，溶于100 μL 30%甲醇/水溶液中，进行F-SPE，最后用50 μL纯甲醇洗脱氟化柱3次，收集洗脱液，真空离心干燥，待MALDI-TOF MS分析。

1.2.3 生物样品中N-聚糖检测取5 μg 1 μg/μL血清样品进行酶解处理(处理方式同1.2.2(1))，待样品冷却至室温后蒸干，向酶解得到的混合物中加入50 μL 0.8% 三氟乙酸，于80 ℃下反应45 min，以除去糖链中唾液酸基团。衍生、纯化条件同1.2.2。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析样品溶解在20 μL 50%甲醇/水溶液中，混合均匀，并取0.5 μL样品溶液与0.5 μL基质(含有5 mg/mL DHB、5 mmol/L NaAc的50%甲醇混合溶液)，点滴在MALDI金属板上，在空气中晾干，待测。质谱分析以正离子模式进行。MALDI激光光源Nd∶YAG (355 nm，400 Hz)，激光强度为5 500，加速电压20 kV，质量扫描范围m/z1 000～5 000。

2 结果与讨论

2.1 DP7的PFHA标记

氟衍生化原理如图1所示。图2(A)是12.5 μL 10 μmol/L DP7溶液与25.0 μL 1.0 mmol/L PFHA溶液，12.5 μL 2%HAc溶液，于65 ℃恒温反应2 h得到衍生化DP7质谱图，可以同时观察到衍生产物DP7-PFHA信号峰[M+Na]+(m/z1607.70)和未经衍生的DP7信号峰[M+Na]+(m/z1175.60)，说明反应未完全。我们采用归一化法对衍生效率进行计算：衍生产物峰面积(H1)除以剩余DP7峰面积(H2)和产物峰面积总和(H1+H2)。以衍生效率为衡量标准，对反应温度、摩尔比、反应时间以及反应酸度进行了优化(图3)，得到DP7最优衍生条件为：反应温度75 ℃，DP7∶PFHA摩尔比为1∶400，反应时间2 h，体系中HAc体积分数为0.5%。在最优条件下的衍生效率达到80%，在此条件下对衍生之后的DP7进行质谱检测(图2(B))，未发现未衍生DP7的峰，而衍生化产物峰[M+Na]+(m/z1607.33)极强，说明该条件下DP7衍生效率高。在此条件下，检测限低至5 nmol/L的衍生化DP7，此时信噪比为10.71。

图2 DP7衍生化质谱图(A)和最优衍生条件下的DP7衍生化质谱图(B)Fig.2 Mass spectrum of DP7-PFHA derivative(A) and Mass spectrum of DP7-PFHA derivative under optimal derivatization conditions(B)

图3 衍生条件对DP7衍生效率的影响Fig.3 Effect of derivatization conditions on derivatization efficiency for DP7(a)reaction temperature;(b)molar ratio of PFHA to DP7;(c)reaction time;(d)volume of acetic acid.

2.2 RNase B中N-聚糖的标记

2.2.1 RNase B酶解缓冲溶液优化实验分别选取了G7、NH4HCO3作为缓冲溶液进行优化，图4(a)、4(b)分别为G7、NH4HCO3作为缓冲溶液，酶切0.1 μg RNase B产物衍生后直接检测的结果，图4(a)中只出现4种N-聚糖信号，均为未衍生聚糖信号，而且有很多杂质出现；图4(b)中，m/z1689.26、1851.29和2013.33信号峰分别对应Man5-7衍生产物[M+Na]+。可能是NH4HCO3热稳定相对较差，在离心干燥过程中会逐步分解脱离样品体系，从而减少其在氟化衍生过程中对体系酸碱度的影响。因此，实验选用NH4HCO3作为缓冲溶液。

图4 不同缓冲溶液条件下RNase B中N-聚糖衍生质谱图Fig.4 Mass spectra of derived N-glycans in RNase B under different buffer solutions (a)NH4HCO3 buffer;(b)G7 buffer.

2.2.2 RNase B中N-聚糖衍生条件优化与标准糖DP7相比较，RNase B中N-聚糖衍生需要进一步优化。我们通过以衍生产物中信号最强的m/z1689.30离子峰峰高作为衡量衍生效率的标准，固定N-聚糖的量为0.1 μg RNase B酶切得到，改变PFHA溶液的浓度和酸度进行衍生，得到的衍生产物以50%甲醇溶液为平衡液进行F-SPE。从图5可以看出，最优衍生条件为：PFHA(4 mmol/L)用量为10 μL，10% HAc溶液为5 μL。在此条件下成功检测到4种中性N-聚糖。

图5 RNase B中N-聚糖衍生质谱图(内插图为PFHA浓度(a)与HAc浓度(b)对衍生效率的影响)Fig.5 Mass spectrum of derived N-glycans in RNase B(Inset:molar ratio of PFHA to DP7(a),volume of acetic acid(b)on derivatization efficiency)

2.3 F-SPE萃取条件的优化

图5中可以看到m/z1689.27、1851.30、2013.32和2175.34这4个信号峰，它们分别对应Man5-8四种产物[M+Na]+离子峰，缺少Man-9衍生产物离子峰，且在该条件下质谱图中出现较多杂峰，这可能是由于所用洗脱条件并不适用于该分析方法，杂质残留，影响聚糖的检测，因此需要对F-SPE洗脱条件进行优化。据此采用不同体积分数的甲醇溶液为平衡液进行F-SPE。仍以质谱图中信号响应最强的m/z1 689.30离子峰峰高作为衡量F-SPE效率的标准，可以发现以30%甲醇为平衡液F-SPE富集效率最高。在此条件下进行质谱检测，可以观察到RNase中Man5-9的5个信号峰(m/z=1689.30、1851.29、2013.37、2175.33和2337.38)。在此条件下，可成功检测到5 ng/μL的RNase B中5种N-聚糖，且信噪比为3.74。

2.4 F-SPE的选择性

在RNase B(0.1 μg)酶解得到的N-聚糖中，加入1 μg BSA以及10 μg NaCl，经过PFHA衍生和F-SPE后，检测结果如图6所示。在非糖基化蛋白和盐浓度较大的情况下，依然可清楚地观测到RNase B中所有N-聚糖Man5-9的5个[M+Na]+离子峰。表明此方法具有良好的选择性和抗干扰性能。

2.5 人血清样品检测

将PFHA衍生结合F-SPE的MALDI-TOF MS方法应用到5 μg 1 μg/μL人血清样品中N-聚糖的检测。按照上述所得的最优条件下进行衍生、纯化、检测(图7)，成功检测到12种N-聚糖。表明该方法在生物样品检测中具有良好的适用性。

图6 加入1 μg BSA及10 μg NaCl后衍生RNase B的质谱图Fig.6 Mass spectrum of derived RNase B after spiked with 1 μg BSA and 10 μg NaCl

图7 人血清中N-聚糖的质谱图Fig.7 Mass spectrum of N-glycans in human serum

3 结论

本文发展了一种PFHA衍生，结合F-SPE后MALDI-TOF MS检测N-聚糖的方法。该方法在增强N-聚糖疏水性，提高其离子化效率的同时实现其高效富集纯化，有效提高生物样品中N-聚糖丰度，降低杂质对其质谱信号的干扰，达到高选择性、高灵敏度检测N-聚糖的目的。通过此方法，我们最终可以检测到5 ng/μL的标准糖蛋白RNase B的所有N-聚糖，并将此方法运用到5 μg血清样品的检测，成功检测到12种N-聚糖。该方法具有操作简便、灵敏度高、选择性强等优点，为复杂生物样品中N-聚糖的分析提供了新的有利方法。