搅拌棒吸附萃取-高效液相色谱-荧光法测定陈皮中黄曲霉毒素

李珺沬， 赵 甜， 刘 岩， 刘圆呈， 鲁雅洁， 蒋 晔*

(河北医科大学药学院，河北石家庄 050017)

黄曲霉毒素(Aflatoxins)具有高毒性和高致癌、致畸、致突变性，它们对人类和动物危害极大[1 - 2]。迄今为止，已经发现多种结构相似且特征已知的黄曲霉毒素类化合物。其中，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2是主要的毒性物质[3 - 4]。目前，对于黄曲霉毒素的研究主要集中于食品和农畜产品[5 - 6]，而对中药材中黄曲霉毒素的相关研究报道较少。中药材在加工、储藏和运输的过程中，很容易发生霉变，产生或被黄曲霉毒素污染[7 - 8]。同时，由于黄曲霉毒素不溶于水，并且耐热性很高，加热到280 ℃才能发生裂解破坏[9]。因此，测定中药材、中药饮片和中药制剂中的黄曲霉毒素对保证用药安全具有重要的意义。目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法[10]、薄层色谱法[11]、荧光分光光度法[12]、免疫亲和柱-高效液相色谱法[13]等。但是这些方法存在稳定性差、假阳性较多、特异性差、灵敏度低等弊端。

搅拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE)是一种集萃取、富集、净化为一体的新型样品前处理技术，该技术具有操作简便、溶剂用量少、富集倍数高和环境友好等优点[14 - 16]。氧化石墨烯具有较高的比表面积和丰富的含氧官能团，近年来以氧化石墨烯作为吸附材料，被广泛应用于食品、环境污染物等的前处理研究[17 - 18]。本研究通过制备多巴胺-氧化石墨烯复合物为涂层的搅拌棒，并用该搅拌棒萃取中药材陈皮中的黄曲霉毒素，同时结合高效液相色谱-荧光检测器对其进行检测。方法具有灵敏度高、重现性好等特点，为中药中黄曲霉毒素的测定提供了一种有效的分析手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

L-6200A高效液相色谱仪(日本，Hitachi公司)；2475荧光检测器(美国，Waters公司)；柱后衍生系统(北京创新通恒科技有限公司)；DF-11集热式磁力搅拌器(金坛市富华仪器有限公司)；HGC-24型氮吹仪(天津恒高技术有限公司)；H1650台式离心机(湖南湘仪试验室仪器开发有限公司)；TYD-300超声清洗器(北京泰元达创公司)。

黄曲霉毒素(AF)对照品溶液(美国Sigma公司)；多巴胺(山东西亚化学工业有限公司)；氧化石墨烯水分散液(济宁利特纳米技术有限责任公司)；碘(济南萧试化工有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；所有其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

1.2.1 对照品溶液精密量取AF B1、AF B2、AF G1、AF G2对照品溶液适量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度分别为200、50、200、50 ng/mL的混合对照品储备液。

1.2.2 样品溶液精密称取已粉碎并过二号筛的陈皮样品粉末约1 g，置于10 mL离心管中，加入0.2 g NaCl，精密加入70%甲醇溶液5 mL[19]，超声5 min，于2 500 r/min离心5 min，精密将取上清液1 mL，置于10 mL西林瓶中，加超纯水稀释至10 mL，备用。

1.3 搅拌棒的制备

参考文献方法[18 - 20]制备搅拌棒。具体方法如下：取含磁子的四氟搅拌棒，置于含2 mg/mL多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)的烧杯中，于30 ℃磁力搅拌水浴锅中缓慢匀速搅拌12 h，取出搅拌棒，于60 ℃恒温干燥箱中干燥30 min，将搅拌棒置于2 mg/mL的氧化石墨烯水分散液中，于65 ℃磁力搅拌水浴锅中反应12 h，取出搅拌棒，于60 ℃恒温干燥箱中干燥30 min。重复以上操作步骤3次，得到具有一定多巴胺-氧化石墨烯复合物涂层厚度的搅拌棒。

1.4 搅拌棒吸附萃取过程

将自制的搅拌棒置于“1.2.2”项下制备的样品溶液中，在磁力搅拌水浴锅中萃取(温度50 ℃，转速300 r/min)20 min，取出搅拌棒，于2 mL甲醇中解吸(搅拌速率为300 r/min)2 min，解吸液于45 ℃氮气流下吹干，并用0.1 mL色谱流动相复溶后，用于高效液相色谱分析。

1.5 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水=40∶18∶42(V/V/V)；流动相流速：0.8 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL；荧光检测：λex=360 nm，λem=450 nm；衍生溶液：0.05%碘溶液，流速：0.3 mL/min；衍生温度：70 ℃。

2 结果与讨论

2.1 搅拌棒涂层厚度的考察

图1 涂层厚度对萃取效率的影响Fig.1 Effect of coating thickness on extraction efficiency

搅拌棒的涂层厚度对萃取效率具有重要影响。本实验考察了在含磁子的四氟搅拌子上，分别涂布1～4层多巴胺-氧化石墨烯复合物后，对AF B1、AF B2、AF G1、AF G2 萃取效率的影响，如图1所示。结果显示，当搅拌棒的涂层为3层时，对4种黄曲霉毒素即可达到最大吸附能力。因此，本实验选择3层厚度的多巴胺-氧化石墨烯复合物涂层搅拌棒对目标组分进行萃取。

2.2 萃取条件的优化

2.2.1 搅拌速率的优化适度的搅拌可以加快固液界面的更新，减小溶液中待测组分的浓度梯度，增加待测组分向萃取基质中的扩散速率，从而缩短萃取时间。本实验考察了不同的搅拌速率(100～500 r/min)对萃取效率的影响，如图2所示。结果显示，随着搅拌速率的增大，目标组分的萃取量逐渐增加，当搅拌速率大于300 r/min时，萃取效率反而降低。因此，选择最佳搅拌速度为300 r/min。

2.2.2 盐效应的影响实验在溶液中加入NaCl来调节离子强度，考察其对萃取效率的影响。分别加入NaCl质量浓度为0%、1%、2%、3%、4%，如图3所示。结果显示，随着离子强度的增加，搅拌棒对4种黄曲霉毒素的萃取效率逐渐降低。因此，为获得最佳萃取条件，本实验不加入NaCl。

图2 搅拌速率对萃取效率的影响Fig.2 Effect of stirring rate on extraction efficiency

图3 盐浓度应对萃取效率的影响Fig.3 Effect of salt concentration on extraction efficiency

2.2.3 萃取温度的优化萃取温度对萃取效率具有重要影响。萃取温度升高，目标组分的传质速率加快，但同时目标组分在萃取相内的分配系数降低。本实验考察了萃取温度为30、40、50、60、70 ℃对萃取效率的影响，结果如图4所示。结果显示，当萃取温度达到50 ℃时，萃取效率达到最高。因此，本实验选择最佳萃取温度为50 ℃。

2.2.4 萃取时间的优化考察不同萃取时间对萃取效果的影响，以色谱峰面积对萃取时间作图，如图5所示。结果显示，从5 min到20 min，随着萃取时间的增加，目标组分的萃取效率逐渐增大，在20 min时达到峰值。随后，继续延长萃取时间至40 min，其响应值增加不超过2%。在充分权衡灵敏度和实验效率的情况下，本实验选择20 min作为最佳萃取时间。

图4 萃取温度对萃取效率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

图5 萃取时间对萃取效率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.3 解吸条件的优化

相对于静态解吸，动态解吸能够加快溶液对流，提高溶液中待测组分的传质速度，加快解吸速率，从而缩短解吸时间。本实验分别考察了超声和搅拌两种模式对待测组分解吸效果的影响。实验结果表明：超声20 min后，搅拌棒的涂层有损失，不利于搅拌棒的重复利用；而在搅拌模式下，涂层稳定，因此采用搅拌模式对待测组分进行解吸。实验分别考察了不同搅拌速率(100、200、300、400、500 r/min)和不同解吸时间(0.5、1、2、3、4 min)的解吸效果，结果显示搅拌速率为300 r/min、解吸时间为2 min时，解吸效果最佳，因此确定该条件作为解吸条件。

2.4 搅拌棒的耐用性考察

本实验考察了搅拌棒的耐用性进。搅拌棒完成1次萃取后，依次用超纯水和甲醇搅拌(300 r/min)各清洗1 min，重复清洗2次，取出搅拌棒，置于60 ℃恒温干燥箱中干燥，以备重复利用。在本实验中，取同一批不含黄曲霉毒的陈皮样品，平行制备30份加标样品，经70%的甲醇溶液超声提取后，用于萃取，以黄曲霉毒的色谱峰面积作为测量参数，结果表明：前25份加标样品测定的各待测组分的峰面积的相对标准偏差(RSD)小于3.1%，30份加标样品测定的各待测组分的峰面积的RSD为7.5%，说明所制备的搅拌棒具有良好的耐用性。由于搅拌棒可以批量制备，数量充足，因此，在本实验中考虑到测量结果的重现性，搅拌棒重复使用20次后即不再继续使用。

2.5 方法学研究与评价

精密吸取含AF B1、AF B2、AF G1和AF G2的混合对照品储备液适量，用甲醇逐级稀释成含4种目标物的系列混合对照品溶液，分别进样分析，记录色谱峰，以峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x，ng/mL)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)=3计，得到该方法的检出限，相关数据均列入表1。取不被黄曲霉毒素污染的陈皮样品，分别向其中添加低、中、高3个浓度水平的混合对照品溶液，测定加标回收率和精密度，结果见表2。

表1 方法的线性实验结果和检出限

表2 加标回收率和精密度(RSD,n=5)结果

图6 混合对照品溶液(a)和阳性陈皮样品(b)色谱图Fig.6 Chromatograms of standards(a) and Pericarpium Citri Reticulatae containing AF B1(b)1.AF G2;2.AF G1;3.AF B2;4.AF B1.

2.6 实际样品分析

在各大型零售药店和药材市场随机购买12批陈皮样品，采用自制的搅拌棒对黄曲霉毒素进行萃取，并进行HPLC-FLD分析，色谱图如图6所示。测定结果表明：1份陈皮样品检测出AF B1，含量为0.8 μg/kg，未超过《中国药典》规定的陈皮中AF B1的最大限量标准5 μg/kg[21]，其它陈皮样品中未见上述4种黄曲霉毒素检出，所有陈皮样品检测合格率为100%。

3 结论

本研究通过制备多巴胺-氧化石墨烯复合物为涂层的搅拌棒对中药材陈皮中的AF B1、AF B2、AF G1和AF G2进行萃取，并结合HPLC-FLD对其进行测定。实验所制备的搅拌棒耐受性好，重复使用次数高。在优化的条件下，对12批陈皮样品进行测定，检测结果均未超过《中国药典》规定的最大限量标准。该方法操作简便，重现性好，准确度高，能够满足陈皮中黄曲霉毒素的测定要求，同时对其它中药材等复杂基质中黄曲霉毒素的测定具有一定的借鉴意义。