抑制TUBB3基因表达对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制研究

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其早期症状不明显，大部分患者确诊时已处于进展期，加之患者对目前的治疗方式有不同程度的不良反应，导致胃癌的治疗效果不佳[1-3]。因此，探索更佳的治疗方法对于提高胃癌治疗效果和改善预后尤为重要。基因治疗是当前研究的热点，在改善肿瘤患者预后中取得了较显著的成果[4]。探究与肿瘤发病、进展相关的基因的作用机制能够为治疗提供靶点。目前研究显示3型β微管蛋白(TUBB3)基因在非小细胞肺癌、乳腺癌、食管鳞状细胞癌等多种肿瘤组织中的表达高于正常组织，提示TUBB3基因表达与肿瘤发生具有一定的相关性[5-7]。多项研究发现胃癌组织中TUBB3基因呈高表达[8-9]，推测TUBB3基因与胃癌发生有一定的关系。本研究采用体外培养人胃癌SGC-7901细胞，观察抑制细胞中TUBB3基因的表达对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学特性的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期为胃癌的治疗和预后提供新的基因靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TUBB3 siRNA及siRNA control(上海吉玛制药技术有限公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司)；实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；反转录试剂盒(美国Promega公司)；SYBR Green Gene Expression Assay试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；CCK-8试剂盒、二甲基亚砜(碧云天生物技术研究所)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(日本Takara公司)；孔径8 μm Transwell小室、Matrigel基质胶(美国BD公司)；PCNA、Cleaved Caspase-3、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体及HRP标记的二抗(美国SantaCruz公司)。

1.2 细胞培养和转染

人胃癌SGC-7901细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素和链霉素双抗)中，置于5% CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养。根据SGC-7901细胞生长状态，每2～3日更换1次新鲜培养液。待细胞生长至汇合度达85%时，以胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期的细胞用于转染实验。转染前24 h将SGC-7901细胞以胰酶消化，将细胞以5×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，置于37 ℃的CO2培养箱中过夜培养。当细胞密度达70%时将TUBB3 siRNA和siRNA control分别转染人胃癌SGC-7901细胞，记为TUBB3 siRNA组和阴性对照组(NC)组，以不做任何处理的人胃癌SGC-7901细胞记为空白对照组(Control组)。转染步骤严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书操作。

1.3 qRT-PCR检测转染后细胞中TUBB3 mRNA表达水平

SGC-7901细胞转染后48 h收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞中RNA，经分光光度计检测RNA纯度和浓度后，以反转录试剂盒合成cDNA，将cDNA浓度调整为50 ng/μL，以SYBR Green Gene Expression Assay试剂盒进行荧光定量PCR扩增，以GAPDH为内参，用相对定量2-△△CT计算细胞中TUBB3 mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot检测细胞中蛋白表达水平

收集转染后48 h的各组SGC-7901细胞，加入细胞裂解液提取各组细胞中总蛋白，蛋白样品经BCA蛋白定量检测试剂盒定量后，取40 μg蛋白样品加样至10%聚丙烯酰胺凝胶上样孔进行电泳。电泳结束后采用湿转法转膜至硝酸纤维素膜上，转膜结束后在含5%脱脂奶粉的封闭液中室温孵育4 h。分别使用TUBB3一抗(1∶800倍稀释)、PCNA一抗(1∶800倍稀释)、Cleaved Caspase-3一抗(1∶1 000倍稀释)、MMP-2一抗(1∶1 000倍稀释)4 ℃孵育过夜。PBST洗涤3次，加入二抗室温孵育2 h。用ECL发光试剂盒显色，在凝胶成像系统曝光拍照，计算目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值表示TUBB3、PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2蛋白相对表达水平。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖能力

将各组SGC-7901细胞分别接种于96孔板中，接种密度为1×103/孔，用CCK-8法分析各组细胞的增殖能力。分别在培养24、48、72 h时进行检测，每个时间点设置3个平行复孔，在每孔细胞中添加10 μL的CCK-8试剂，置于37 ℃培养箱中继续培养4 h，在酶标仪450 nm处检测各孔细胞的吸光度值(A值)。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡水平

将转染后48 h的各组SGC-7901细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，收集至EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，离心去上清，用结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL碘化丙啶轻轻混匀，再加入5 μL Annexin V-FITC室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞的凋亡率。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力

Matrigel基质胶用无血清培养基稀释(置冰上操作)，将稀释的Matrigel胶铺于Transwell小室膜底部，晾干待用。将转染后48 h的各组SGC-7901细胞消化收集，用无血清培养基重悬细胞，制成2×105个/mL的单细胞悬液，取200 μL接种于含Matrigel胶的Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，置于37 ℃培养箱中继续培养24 h，取出Transwell小室，PBS轻轻洗涤2次，拭去上室细胞，甲醇固定10 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤3次后在显微镜下随机选取5个视野观察计数穿膜细胞数。实验重复3次并取平均值，以侵袭细胞数量表示细胞侵袭能力。用相同方法检测细胞迁移能力，Transwell小室不以Matrigel胶包被，其余步骤与侵袭实验相同。

1.8 统计学处理分析

2 结果

2.1 转染后各组SGC-7901细胞中TUBB3 mRNA和蛋白表达水平

转染后48 h，采用qRT-PCR和Western blot检测各组SGC-7901细胞中TUBB3 mRNA和蛋白的表达水平，Control组与NC组细胞中TUBB3 mRNA和蛋白表达水平相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与NC组比较，TUBB3 siRNA组细胞中TUBB3 mRNA和蛋白的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示转染TUBB3 siRNA能够抑制SGC-7901细胞中TUBB3的表达。见图1、表2。

图1 各组SGC-7901细胞中TUBB3蛋白的表达水平表2 各组SGC-7901细胞中TUBB3 mRNA和 蛋白的表达水平()

组别TUBB3 mRNATUBB3蛋白Control组1.000.35±0.04NC组1.02±0.1a0.31±0.03aTUBB3 siRNA组0.34±0.04b0.12±0.01bF值116.17252.269P值0.0000.000

注：与Control组相比，aP>0.05；与NC组相比，bP<0.05

2.2 抑制SGC-7901细胞中TUBB3的表达对细胞增殖的影响

CCK-8试剂盒检测各组SGC-7901细胞在转染24、48、72 h的A值。TUBB3 siRNA组细胞的A值在转染后48、72 h均低于NC组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。Control组与NC组细胞在各时间点的A值相比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。结果提示下调SGC-7901细胞中TUBB3的表达能抑制细胞增殖。见表3。

表3 抑制TUBB3表达对SGC-7901细胞增殖的影响()

注：与Control组相比，aP>0.05；与NC组相比，bP<0.05

2.3 抑制SGC-7901细胞中TUBB3的表达对细胞凋亡的影响

细胞转染后48 h，流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞凋亡率，Transwell实验检测各组SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力。 Control组与NC组的细胞凋亡率、侵袭细胞数和迁移细胞数相比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。与NC组比较，TUBB3 siRNA组的细胞凋亡率显著升高，侵袭细胞数和迁移细胞数显著减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结果提示抑制SGC-7901细胞中TUBB3的表达能促进细胞凋亡，抑制细胞的侵袭和迁移能力。见图2～4、表4。

图2 流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞的凋亡率 A Control组 B NC组 C TUBB3 siRNA组

图3 Transwell实验检测各组SGC-7901细胞的侵袭能力 A Control组 B NC组 C TUBB3 siRNA组

图4 Transwell实验检测各组SGC-7901细胞的迁移能力 A Control组 B NC组 C TUBB3 siRNA组

2.4 抑制TUBB3的表达对PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，Control组与NC组细胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表达水平相比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；与NC组比较，TUBB3 siRNA组细胞中PCNA和MMP-2蛋白表达水平显著降低，Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结果提示抑制SGC-7901细胞中TUBB3表达能诱导细胞中Caspase-3蛋白活化，抑制PCNA和MMP-2蛋白表达。见图5、表5。

表4 各组SGC-7901细胞的凋亡率、侵袭和迁移能力比较()

注：与Control组相比，aP>0.05；与NC组相比，bP<0.05

图5 Western blot检测各组SGC-7901细胞中PCNA、 Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表达水平表5 各组SGC-7901细胞中PCNA、Cleaved Caspase-3 和MMP-2蛋白的表达水平比较()

组别PCNACleaved Caspase-3MMP-2Control组0.48±0.080.05±0.010.39±0.04NC组0.51±0.05a0.08±0.02a0.41±0.04aTUBB3 siRNA组0.17±0.02b0.42±0.05b0.13±0.01bF值34.290126.70066.546P值0.0010.0000.000

注：与Control组相比，aP>0.05；与NC组相比，bP<0.05

3 讨论

在中国胃癌具有发病率高、病死率高等特点，多数患者就诊时已处于进展期，虽然目前胃癌的治疗模式有一定的疗效，但总体治疗水平有待提高，探索有效治疗胃癌的方法具有重要意义[10]。胃癌的发生、发展是由多基因调控的过程[11]，从胃癌发生、发展相关基因入手，抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为是治疗胃癌亟需解决的问题[12]。TUBB3基因编码的蛋白属于微管类蛋白，目前研究显示TUBB3基因属于胃癌患者抗微管化学治疗药物耐药性相关基因，用TUBB3基因表达水平反映抗微管化学治疗药物的疗效[13-14]。TUBB3基因与胃癌病情相关的研究较少，近年来研究发现，胃癌组织中TUBB3基因的表达水平与抗侵袭基因的表达水平呈负相关，与促侵袭基因表达水平呈正相关，且TUBB3基因过表达能诱导胃癌细胞的侵袭活性[9,15]。抑制PTEN/Akt信号通路能降低TUBB3和TOP2A的表达水平，随后通过ATP和Caspase-3信号通路抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖和诱导细胞凋亡[16]。TUBB3基因可作为预测食管癌预后的独立标志物，可能是食管腺癌患者诊治中常规应用的有价值的生物标志物，特别是用于新辅助治疗和手术后个体辅助治疗[17]。本研究中通过转染抑制人胃癌SGC-7901细胞中TUBB3的表达，采用CCK-8检测抑制TUBB3表达对细胞增殖的影响，结果显示可抑制细胞增殖能力。采用流式细胞仪检测SGC-7901细胞凋亡率，采用Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力，结果显示TUBB3表达下调的SGC-7901细胞的凋亡率升高，侵袭和迁移能力均被抑制，提示抑制TUBB3基因表达能抑制SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡，表现出一定的抑癌作用。

此外，本实验采用Western blot检测SGC-7901细胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白的表达水平，发现抑制TUBB3表达的SGC-7901细胞中PCNA和MMP-2蛋白水平显著降低，Cleaved Caspase-3水平显著升高。PCNA目前作为评价细胞增殖状态的指标，其阳性表达提示细胞处于增殖状态，目前已在胃癌、肝癌等多种肿瘤中应用[18-19]。Caspase-3是Caspase家族的重要成员，该蛋白激活(Cleaved Caspase-3)能促使细胞发生凋亡[20]。MMP-2是MMP家族成员，与细胞外基质的重塑和降解有关，研究显示MMP-2与肿瘤的浸润及转移密切相关[21]，目前已将其作为肿瘤细胞发生侵袭和转移的指标。本研究结果说明抑制人胃癌SGC-7901细胞中TUBB3基因的表达能通过下调PCNA表达来抑制细胞增殖，活化Caspase-3以促进细胞凋亡，抑制MMP-2的表达以阻遏细胞的侵袭和迁移。

本实验的不足之处在于，仅采用单一细胞株进行研究，且缺乏体内试验验证，后续相关研究将在不同细胞株中进行，并将结合小鼠模型实验进一步验证。

综上所述，本研究采用RNA干扰技术抑制人胃癌SGC-7901细胞中TUBB3基因的表达，可抑制细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与调控细胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表达水平有关。本研究证实了抑制TUBB3基因对人胃癌SGC-7901细胞生物学特性的影响，但TUBB3基因在其他胃癌细胞系中是否有相同的作用，今后将继续进行探讨。对TUBB3基因功能的研究提示以TUBB3基因为治疗靶点具有一定的开发前景。