组织蛋白酶S对HIV相关神经认知功能障碍的调控作用及其机制研究

罗 涟 师金川 颜廷波 倪霜玲 周佳君

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是世界上首要的公共卫生问题，截止2015年底，全球已有AIDS患者近400万，其中我国50余万人[1]。在我国，HIV感染者中HIV相关神经认知功能障碍(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)已达40%。HAND已成为HIV感染者死亡的重要原因，寻找早期识别、诊断、治疗HAND的方法成为当下迫切需要解决的问题。有研究显示，HIV患者半胱氨酸组织蛋白酶S(cathepsin S，CTSS)水平升高，并与脑脊液中HIV-1载量呈正相关[2]。而其内源性抑制剂胱抑素C(cystatin C，Cys C)在HAND患者中水平下降[3]。有研究者认为，CTSS可能通过促进gp120与CD4结合，进而加速病毒与宿主细胞的膜融合，从而导致HAND的发生与进展[4,5]。本研究拟通过对HAND患者与non-HAND患者脑脊液和血浆进行检测，分析其CTSS、Cys C表达水平和HIV RNA、gp120蛋白水平，从而明确HAND患者CTSS、Cys C表达水平的特征性改变及与HIV病毒载量、HIV表面蛋白gp120的关系，分析CTSS、Cys C水平与疾病发生的相关性，为HAND预防和治疗提供新的思路及理论依据。

资料与方法

1.一般资料:选择自2015年6月～2017年6月期间在笔者医院治疗的30例HAND患者作为研究对象，HAND的诊断标准：联合运用国际HIV痴呆量表(IHDS)、Hopkins言语学习测试、利手和非利手Grooved Pegboard实验(Grooved Pegboard dominant and non-dominant Hands)、接龙试验A和B(trail making test: parts A and B)、中国修订韦氏成人智力量表(Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised by China, WAIS-RC)进行诊断[6,7]。其中，男性21例，女性9例，患者年龄18～50岁，平均年龄35.75±9.43岁。选择30例HIV非神经认知功能障碍患者(non-HAND)作为对照，其中，男性20例，女性10例，患者年龄18～48岁，平均年龄36.04±8.97岁。HAND组和non-HAND组患者年龄、性别等一般资料之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：①年龄18～50岁，男女性别不限；②市疾控中心检测确诊HIV阳性的AIDS患者；③小学及以上文化程度；④意识清楚，能配合完成量表检查；⑤既往无精神疾病史，无精神病阳性家族史；⑥患者或其法定监护人自愿参加并签署知情同意书。排除标准：①活动性心理障碍；②活动性或既往中枢神经系统机会性感染；③乙醇中毒；④既往吸食过鸦片、大麻、可卡因、海洛因等毒品或毒品成瘾者；⑤肢体残疾(如截肢)、严重机能障碍或严重内科疾病而影响神经心理测试。本研究获得了笔者医院医学伦理学委员会的批准，所有受试者均签署了知情同意书。

2.脑脊液和血浆中CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平检测：以无菌方法取所有入组患者脑脊液3～5ml，冻存于-80℃冰箱中待测。采集EDTA抗凝静脉血即刻1800r/min 离心分离血浆，冻存于-80℃冰箱中待测。从-80℃冰箱中取出脑脊液和血浆样品，分成2份，其中1份用于检测CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，使用RNA提取试剂盒(货号：4449079，批号：2015020301，美国Thermo Fisher Scientific公司)提取CTSS mRNA、Cys C mRNA，HIV RNA，然后使用反转录酶试剂盒(货号：K1622，美国Fermentas公司)合成cDNA，通过反转录PCR(RT-PCR)试剂盒(货号：10928042，批号：201501057，美国Thermo Fisher Scientific公司)检测CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，以GAPDH mRNA作内参，采用2-ΔΔCt法分析mRNA或RNA的相对表达水平。另一份脑脊液和血浆样品用于检测CTSS、Cys C、gp120蛋白水平。

3.脑脊液和血浆中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平：取另一份脑脊液和血浆样品，使用酶联免疫吸附法试剂盒检测脑脊液和血浆中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平，CTSS、Cys C蛋白ELISA检测试剂盒购于英国Abcam公司，货号分别为ab155427、ab119589，批号分别为A201801042、A201802041。gp120蛋白ELISA检测试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司，货号为SBJ-H1622，批号为20180304251。所有试剂盒检测操作方法均严格按照试剂盒说明书进行，每个样本检测3个复孔。

结 果

1.脑脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND组患者脑脊液中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均显著高于non-HAND组，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平显著低于non-HAND组，差异有统计学意义(P=0.000)，详见表1。

表1 HAND组和non-HAND组脑脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比较

2.血浆中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND组患者血浆中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均显著高于non-HAND组，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平显著低于non-HAND组，差异均有统计学意义(P=0.000)，详见表2。

表2 HAND组和non-HAND组血浆中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比较

3.CTSS表达水平与HIV RNA相关性:脑脊液(CSF)中CTSS mRNA水平与HIV RNA水平(r=0.61)、CTSS蛋白水平与HIV RNA水平(r=0.60)以及血浆中CTSS mRNA水平与HIV RNA水平(r=0.53)、CTSS蛋白水平与HIV RNA水平(r=0.60)均呈正相关，详见图1。

图1 CTSS表达水平与HIV RNA水平相关性

4.CTSS表达水平与gp120相关性:脑脊液(CSF)中CTSS mRNA水平与gp120蛋白水平(r=0.79)、CTSS蛋白水平与gp120蛋白水平(r=0.64)以及血浆中CTSS mRNA水平与gp120蛋白水平(r=0.64)、CTSS蛋白水平与gp120蛋白水平(r=0.59)均呈正相关，详见图2。

5.Cys C表达水平与HIV RNA相关性:脑脊液(CSF)中Cys C mRNA水平与HIV RNA水平(r=-0.71)、Cys C蛋白水平与HIV RNA水平(r=-0.50)以及血浆中Cys C mRNA水平与HIV RNA水平(r=-0.52)、Cys C蛋白水平与HIV RNA水平(r=-0.43)均呈负相关，详见图3。

6.Cys C表达水平与gp120蛋白相关性:脑脊液(CSF)中Cys C mRNA水平与gp120蛋白水平(r=-0.76)、Cys C蛋白水平与gp120蛋白水平(r=-0.36)以及血浆中Cys C mRNA水平与gp120蛋白水平(r=-0.44)、Cys C蛋白水平与gp120蛋白水平(r=-0.57)均呈负相关，详见图4。

图2 CTSS表达水平与gp120蛋白水平相关性

图3 Cys C表达水平与HIV RNA水平相关性

图4 Cys C表达水平与gp120蛋白水平相关性

讨 论

HIV病毒除了破坏免疫系统，它还引发神经认知疾病[8,9]。高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)是目前临床上治疗艾滋病最有效的方法，降低了发生率和病死率，但HAND发生率并未改善。2016年，Fields等[10]研究显示，HAND的发生率可达到50%左右。HAND的早期诊断和治疗显然已经迫在眉睫。

目前，关于HIV感染中枢神经系统的发病机制尚未明确，其研究集中于HIV直接或间接对神经系统的损伤以及宿主发生免疫应答导致的神经毒性作用[11,12]。受HIV-1感染的单核-吞噬细胞、胶质细胞可释放病毒蛋白如Tat、Vpr、Nef，以及囊膜糖蛋白Env的表面蛋白gp120和跨膜蛋白gp41等，均可参与直接的中枢神经毒性反应[13]。而HAND的间接发病机制与小胶质细胞、脑巨噬细胞和中枢神经系统中炎性细胞因子造成的炎性反应及脑屏障的通透性改变有关[14]。以上两种致病机制最终均是通过神经细胞的凋亡而引起HAND。

半胱氨酸组织蛋白酶S(cathepin S，CTSS)是半胱氨酸组织蛋白酶家族中的成员，具有降解细胞内及细胞外基质的功能，调控血管内皮细胞的完整性[15]。有研究发现CTSS抑制剂对脑外伤小鼠具有一定的神经保护作用，提示CTSS可能是治疗神经系统损伤的一个潜在分子靶标[16]。CTSS表达水平与内源性抑制剂胱抑素C(cystatin C，Cys C)呈正相关，CTSS/Cys C比例平衡维持其生理功能[17]。通过蛋白质组学研究发现，cystatin C在HAND患者CSF中水平下降[18]。而细胞实验显示cystatin C具有抗HIV作用，进一步提示CTSS在HAND的发病过程中起到重要作用[19]。

本研究结果发现，在HAND患者的脑脊液和血浆中CTSS表达水平显著高于non-HAND患者，同时HIV病毒载量和gp120蛋白表达水平也显著高于non-HAND患者，而笔者检测Cys C蛋白表达水平结果发现，HAND患者脑脊液和血浆中CysC蛋白表达水平均显著降低，与Laspiur等[18]研究结果一致。由此结果可以看出，HAND患者脑脊液和血浆中CTSS表达水平与HIV病毒载量以及gp120蛋白水平均呈正相关，而Cys C表达水平与HIV病毒载量和gp120蛋白表达水平均呈负相关。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。在病毒入侵过程里，gp120结合细胞表面受体CD4和复合受体CCR5或CXCR4，触发Env巨大的构象变化，然后gp41膜融合蛋白又通过一连串的大范围的蛋白质重折叠，最终导致病毒与宿主细胞的膜融合[20]。笔者分析认为CTSS表达对抗原递呈和组织重构中的胞内和胞外蛋白转换相关，CTSS可能通过促进gp120与CD4结合，进而加速病毒与宿主细胞的膜融合，从而导致HAND的发生与进展。而以CTSS为靶标，通过干预CTSS表达水平，以纠正CTSS/Cys C这一失衡状态为切入点可能为HAND治疗提供新的思路。

本研究存在以下不足之处，首先由于技术手段限制未能检测CD4+、CD8+、CD3+淋巴细胞水平,其次没有检测随访结果，因此未能就HAND紧张情况做进一步研究；最后，由于样本量较小，相关研究结果需要进一步扩大样本量进行研究。综上所述，HAND患者体内CTSS水平较高，Cys C水平较低，CTSS可能促进HIV与宿主细胞膜的融合从而促进HAND的发展，但还需要进一步研究证实。