RANK基因甲基化与新疆汉、维吾尔、哈萨克族老年男性肥胖相关性研究

赛娅热·雪克拉提 李杨静 白 雪 向 红 王红梅

随着社会经济的高速发展以及人们生活水平的日益提高，生活方式和饮食结构逐渐发生改变，肥胖已成为当今社会的公共健康问题。全球约有17亿超重人群和3亿肥胖者。中国超重及肥胖者人数在过去的20年内增长了4倍。肥胖是遗传和环境因素共同作用的结果。随着研究的深入，表观遗传与肥胖发生的关系日益受到重视，许多研究揭示了DNA 甲基化与肥胖之间存在关联性[1～3]。

DNA甲基化是一种表观遗传修饰方式且为可逆的DNA自然化学修饰方式。DNA甲基化是指以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，在DNA甲基转移酶的作用下将甲基转移到胞嘧啶的C-5上。DNA甲基化主要发生在基因的5′端启动子对称CpG序列中的C碱基上。CpG岛的甲基化会干扰一些转录因子与基因调控区的结合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表达[1]。

DNA 甲基化已经广泛应用于糖尿病、骨性关节炎及各种肿瘤疾病发病机制的研究。目前，在肥胖研究中对DNA甲基化的研究还较少。针对核因子-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)基因甲基化与肥胖之间相关性的研究报道甚少，因此本研究从表观遗传学角度入手，以RANK基因为切入点，通过比较新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性肥胖者RANK基因启动子区CpG位点甲基化状态的差异，来探讨该基因DNA甲基化与3个民族肥胖的相关性，为肥胖发病机制的进一步研究提供基础。

对象与方法

1.研究对象:本研究是以自然人群横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究。即采用多级随机抽样的方法，对新疆维吾尔自治区木垒县、洛浦县有本地正式户口、65岁以上的长住汉族、维吾尔族、哈萨克族居民进行流行病学现况调查。调查前事先登记人口，保证应答率，保证入选个体均为无关个体。共调查研究对象维吾尔族1080例(应答率85%)，哈萨克族1106例(应答率88%)及汉族1300例(应答率84%)。

调查采用问卷调查方法，调查工作主要由经过统一培训的专职人员填写表格、询问病史。所有研究对象均收集一般资料，包括年龄、静息血压、吸烟饮酒史、糖尿病、高血压病史，抽取空腹状态下全血5ml，现场离心分离血清和血液有形成分，血清在采血后1个月内检测血脂包括总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerid，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、肌酐、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血糖等生化指标，血液有形成分在-80℃保存，以提取DNA。生化检测均在新疆维吾尔自治区人民医院(三级甲等医院)检验科完成并由专人负责。在以上获得人群样本中随机抽样，最后共有32例汉族、28例维吾尔族、30例哈萨克族老年男性入选本研究。

按《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》标准诊断中心性肥胖：男性腰围≥85cm、女性腰围≥80cm者为中心性肥胖。按照随机、对照原则，在入选研究的老年肥胖男性中选择汉族16例、维吾尔族16例、哈萨克族15例作为病例组，在入选研究的老年非肥胖男性中选择汉族16例、维吾尔族12例、哈萨克族15例作为对照组。所有研究对象均签署知情同意书。本研究通过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理学委员会审查并同意实施。

2. 研究方法：(1)外周血基因组DNA提取：抽取受试者外周血5ml,-80℃保存。应用PAXgene Blood DNA kit 试剂盒(德国Qiagen公司)，并按照试剂盒中提供的“操作说明”中的标准操作步骤提取外周血基因组DNA。(2)RANK启动子区甲基化检测：使用Methyl Primer Express v1.0设计重亚硫酸盐测序引物：上游引物5′-GGTGCCTTTCTAGAATTTGGTGG -3′；下游引物： 5′-CCAACCCTAAATTACCCTTCAC -3′，PCR产物长度376bp，共20个CpG位点。应用EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits(德国Qiagen公司)进行基因组甲基化修饰，并对修饰后的DNA进行反复洗脱、纯化，洗脱纯化的DNA放入-20℃保存。取质检合格的上述基因组DNA样本进行PCR扩增，并将PCR扩增产物回收。回收的PCR扩增产物送上海生工测序，并采用BiQ Analyzer 分析软件对RANK基因组标准序列和测序序列进行比对。

结 果

1.新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性研究对象临床特征:在新疆哈萨克族老年男性研究对象中，病例组、对照组间的高密度脂蛋白胆固醇比较差异有统计学意义(P<0.05)；在新疆维吾尔族老年男性研究对象中，病例组、对照组间总胆固醇、糖尿病及高血压发生率比较差异有统计学意义(P<0.05)；在新疆汉族老年男性研究对象中，病例组、对照组间年龄、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

2.新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性RANK基因甲基化率差异:在新疆汉、维吾尔、哈萨克族老年男性病例组中RANK基因甲基率没有差异(F=2.875，P=0.067)；对照组中，3个民族RANK基因甲基率也没有差异(F=1.007，P=0.374)。新疆汉、维吾尔、哈萨克族老年男性RANK基因CpG岛甲基化率比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表1 新疆汉、维吾尔、哈萨克族研究对象临床资料分析

*P<0.05

表2 新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性RANK基因甲基化率差异

3.RANK基因甲基化与新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性肥胖相关性:在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率高于病例组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表3。

表3 新疆汉、维吾尔、哈萨克族肥胖与RANK基因甲基化相关性分析

采用协方差分析，在校正年龄、吸烟、饮酒、高血压患病率、血脂后，在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率高于病例组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4。

表4 新疆汉、维吾尔、哈萨克族校正年龄、吸烟、饮酒、高血压发生率、血脂后肥胖与RANK基因甲基化相关性分析

讨 论

DNA甲基化属于表观遗传修饰之一，不改变DNA序列，只影响基因转录活性。既往研究证实肥胖与多种基因的甲基化有密切相关性[4～7]。Kuehnen等[2]研究发现，阿片-促黑素细胞皮质素原基因的甲基化率在肥胖儿童血液中显著高于正常者，同时发现该基因的甲基化通过减少促黑素α的分泌，进而增加摄食导致肥胖。在肥胖者血液中表现为高甲基化的基因还有生物钟基因，该基因与生物钟节律有关，并影响饥饿激素的分泌[8,9]。另有诸多基因在肥胖者血液中表现为低甲基化水平，如瘦素基因启动子区甲基化程度降低可促进瘦素表达增加，以对抗肥胖发生[10]。目前，针对RANK基因甲基化与肥胖之间相关性的研究报道甚少，因此本研究探讨RANK基因甲基化与新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性肥胖相关性。

护骨素(osteprotegerin, OPG)、RANK及其配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)是RANKL/RANK/OPG信号通路的3个主要蛋白，该信号通路是调节骨代谢的关键通路。正常生理情况下RANK通过与其受体RNA结合，刺激破骨细胞活化和骨吸收，而OPG通过竞争性抑制RANKL与RANK的结合，从而抑制骨吸收。研究表明，除参与骨代谢外，RANKL/RANK/OPG信号通路也参与细胞增殖和凋亡、动脉粥样硬化、血管钙化、肿瘤骨转移、炎症和免疫等多种病理生理过程。

有文献报道基因甲基化率存在民族/种族差异，但关于RANK基因甲基化率的民族差异，目前尚未见报道[11,12]。本研究首先就维吾尔族、哈萨克族、汉族3组间甲基化率进行了单因素方差分析，分析结果证实3个民族老年男性中RANK基因甲基化率比较差异无统计学意义。DNA甲基化过程是可逆的，甲基化程度可能受到疾病、环境、年龄等混杂因素的影响。Milagro等[13]的研究发现基因甲基化程度可能与年龄相关。研究证实，在肥胖者中，甲基化水平高的生物钟基因，与体重指数、腰围呈显著正相关。

本研究采用协方差分析，校正年龄、吸烟、饮酒、高血压发生率以及血脂水平后，在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性中，对照组RANK基因CpG岛甲基化率均高于病例组，证实RANK基因甲基化变异与肥胖相关，且在非肥胖者中甲基化水平增高。廖二元教授等的动物模型研究发现，OPG基因敲除小鼠存在糖脂代谢异常及胰岛素抵抗，此结果提示RANKL/RANK/OPG信号通路可能参与糖代谢，并与胰岛素抵抗相关，但其具体机制尚不清楚。最近一项通过15年随访研究发现，血液中RANKL水平较高的人群患2型糖尿病的风险增加，而阻断RANKL/RANK/OPG信号通路可能具有预防糖尿病发生的作用。由此推测，在某种程度上，RANK基因甲基化变异参与调节糖脂代谢，参与老年肥胖的发生、发展。

综上所述，在新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族老年男性中，RANK基因甲基化率降低可能与肥胖相关。这些发现对推动肥胖精准化研究及治疗均具有重要意义。值得注意的是，现有的研究仍然处于探索阶段，虽然已经证明了RANK基因甲基化变异可影响肥胖的发生，而引起甲基化状态发生改变的具体机制目前还不清楚，今后拟进一步增大样本量，并深入研究多种基因的DNA甲基化发生情况以及DNA甲基化与肥胖之间的关系。