柴胡白芍提取液对小鼠抑郁样行为的影响

张 蕾 牟翔宇 孙 鹏 于 洋 郜彦鑫 郭英慧

柴胡的基本功效是疏肝解郁，升举阳气，透表泄热，在众多抗抑郁复方中，柴胡类方占有重要地位，约占总数的1/3[1]。众多实验表明，逍遥散、四逆散、柴胡疏肝散、安神解郁汤等在调节抑郁样情绪方面有显著效果，归纳看来，此类方剂均以柴胡为君药，疏肝解郁，和解表里，以白芍为臣药，养血柔肝，敛阴收汗，二者配伍使用一散一收，相互展其长而避其短[2,3]。现代药理研究表明，这些方剂中主要起效物质为柴胡皂苷和芍药苷[4]。柴胡皂苷是柴胡中最主要的活性成分，具有抗肝纤维化、抗病毒、保护肝细胞、抗肿瘤、抗炎、免疫的作用[5]。芍药的主要活性成分为芍药苷，芍药苷对抗伤害性疼痛、免疫、抵抗炎症等方面具有积极的作用[6]。虽然柴胡与白芍常配对出现在抗抑郁的处方中，但鲜有关于二者有效成分单独配伍使用，对小鼠抑郁样行为影响的报道，故本研究将就此进行探讨。

材料与方法

1.实验材料：SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量18～22g，150只，日龄21～27天。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。采用按体重匀齐分组的方法将150只C57BL/6雄性小鼠分为3个组，即旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验组，再将3个实验组分别分为5组，即空白对照(control)组、氟西汀组、柴芍高剂量组、柴芍中剂量组和柴芍低剂量组，每组10只，5只一笼分笼饲养。小鼠于实验室进行适应性饲养1周，保持12h/12h明暗周期，昼夜颠倒，常规喂食喂水。所有动物实验操作遵从于美国NIH颁布《实验动物护理和使用指南》。适应性饲养结束后，小鼠按照药量体质量比0.1ml/10g标准开始灌胃给药，阳性对照组灌胃氟西汀药液。柴胡白芍(以下简称柴芍)高、中、低剂量组，空白对照组给予同等量的载体溶剂。

2.试剂与仪器：柴胡提取液、白芍提取液均由山东中医药大学实验中心药剂实验室提供。柴胡、白芍按12∶10的生药用量配伍(出自柴胡疏肝散)再通过人和小鼠的体表面积换算，计算出柴芍提取液低剂量组的浓度，依次进行两倍的换算推出高、中两个剂量，最后得出柴胡、白芍按1.00g/kg∶0.80g/kg、0.50g/kg∶0.40g/kg、0.25g/kg∶0.20g/kg 3个高、中、低比例配伍，再分别回流提取2次10倍量的70%乙醇，每次提取1.5h，合并2次提取液，过滤除去药渣，滤液减压回收乙醇，并将提取液放于4℃冰箱保存[7，8]。氟西汀分散片购自礼来苏州制药有限公司，批号:L01810，给药时浓度为2mg/kg；Smart 3.0.0.5动物行为学分析系统、XR-SuperMaze动物行为分析系统、XR-XZ301旷场实验系统、小鼠悬尾实验箱体、小鼠强迫游泳装置等均购自上海欣软信息科技有限公司。

3.小鼠旷场实验：小鼠旷场实验在灌胃第8天进行测试。测试当天，各组小鼠均在用药后0.5h进行实验，轻抓握小鼠颈背部皮肤，放置于旷场箱的中央区域，待手完全不在视频范围中时，操作软件开始记录分析，每只小鼠采集时间为6min，由计算机记录小鼠的运动轨迹，并分析中央区滞留时间(s)。

4.小鼠悬尾实验：小鼠悬尾实验在灌胃第8天进行测试。通过固定小鼠的尾部，使小鼠头部向下，记录处于该绝望状态中小鼠产生的一系列不动参数。测试当天，各组小鼠均在用药后0.5h进行实验，小鼠尾端(在距尾尖2cm处)用胶带固定在悬尾箱的中间横杆上，使其呈倒悬状态，头部离悬尾箱底部约15cm。适应2min后，利用软件分析记录4min之内，累计不动时间(s)。

5.小鼠强迫游泳实验：小鼠强迫游泳实验在灌胃第8天进行测试。测试前1天小鼠放入高20cm、直径10cm的圆柱型小鼠强迫游泳桶中适应性游泳5min，测试当天，给药0.5h后将小鼠放入游泳桶中，每桶1只，水深10cm，水温25±2℃，利用软件分析记录小鼠6min内的悬浮不动时间、悬浮不动潜伏期及悬浮不动次数。

结 果

1.柴芍提取液对小鼠旷场中央区停留时间的影响：柴芍高剂量组和柴芍低剂量组相比空白对照组，差异无统计学意义，而柴芍中剂量组和氟西汀组可明显增加小鼠在中央区停留时间(P<0.05)，改善其抑郁样行为。中剂量组柴胡白芍提取液可以明显改善小鼠抑郁样行为，增加OFT实验中小鼠的中央区停留时间，详见表1。

表1 柴胡白芍提取液对小鼠中央区停留时间的影响(C57BL/6小鼠)

与空白对照组比较，*P<0.05

2.柴胡白芍提取液对小鼠悬尾的影响：柴芍高、中、低剂量组和氟西汀组对比空白组可缩短小鼠悬尾不动时间(P<0.05)，上述剂量柴胡白芍提取液可显著改善C57BL/6小鼠的抑郁样行为，其中以氟西汀组和柴芍高剂量组效果更好，从而说明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁样行为的作用，详见表2。

表2 柴胡白芍提取液对小鼠悬尾不动时间的影响(C57BL/6小鼠)

与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

3.柴胡白芍提取液对小鼠强迫游泳不动时间的影响：柴芍高、中、低剂量组和氟西汀组对比空白对照组，可明显缩短小鼠强迫游泳不动时间(P<0.05)，上述剂量柴胡白芍提取液可显著改善C57BL/6小鼠的抑郁样行为，其中以氟西汀组和柴芍低剂量组效果更好，从而说明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁样行为的作用，详见表3。

表3 柴胡白芍提取液对小鼠强迫游泳不动时间的影响(C57BL/6小鼠)

与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

讨 论

杨洁等[9]通过对比柴胡加龙骨牡蛎汤组、单味柴胡组、小柴胡类方组(去柴胡)、非小柴胡组(桂枝、茯苓、大黄、龙骨、牡蛎)发现，虽柴胡组、非小柴胡组都能明显缩短小鼠悬尾不动时间，增加5-HT诱导小鼠甩头次数，但仍以全方柴胡加龙骨牡蛎汤的抗抑郁作用更好。于春泉等[8]通过对比柴芍高、中、低剂量组，白芍高、中、低剂量组，柴胡高、中、低剂量组，空白对照组以及氟西汀组，发现在强迫游泳实验和悬尾实验中各给药组均能明显减少小鼠的不动时间，但柴芍高剂量组对小鼠不动时间的影响更为显著。综上所述，柴胡、白芍配伍使用对比柴胡、白芍单用时抗抑郁效果更明显，且柴胡、白芍配伍使用不仅具有协同作用，还可以减少白芍单煎时有害物质苯甲酸的量、在大鼠的肠道中柴胡皂苷可促进芍药苷的吸收、促进白芍中芍药苷溶出量等积极作用[11～13]。本研究中的柴胡白芍配伍比例出自明代张介宾《景岳全书》中的柴胡疏肝散，为疏肝解郁的良方，在临床抗抑郁方面，取得了确切疗效[13]。

脑内单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)的代谢失常是抑郁症发病机制的经典学说[14]。目前，国际上抗抑郁的一线药物氟西汀、地西帕就分别是5-HT和NE的再摄取抑制剂[15]。柴胡提取液和白芍提取液中发挥主要药理作用的物质分别为柴胡皂苷和芍药苷[16]。戈宏焱等[16]用柴芍皂苷对抑郁大鼠进行干预后，发现大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)的表达和脑内单胺类神经递质及其代谢产物多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、高香草酸(HVA)的含量在原来下调的基础上均有明显的改善。此外，王静霞等[17]通过白芍提取液干预抑郁大鼠发现，给药后抑郁大鼠的行为变化显著改善，大鼠脑内5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)含量增加。

OFT、TST和FST是评价抗抑郁药作用常用的3种动物模型[19，20]。OFT是一项探究小鼠自发活动和探索运动的经典行为学实验，常用来检测抗抑郁和焦虑药物。其原理是利用啮齿类动物处于抑郁状态时，其活动范围会选择相对安全的旷场箱体四周，避开相对空旷的旷场中央，当啮齿类动物只要进入空旷的中央区域，抑郁样情绪改变的动物，会对向箱体四周活动产生迟疑，进而增加了中央区域停留时间。啮齿类动物被放置在特定的环境中由于无法逃脱，呈现出行为上的绝望，是悬尾和强迫游泳的实验原理。因此该实验选用这3种方法评价柴胡白芍提取液的对抑郁样行为的影响，更具有科学性。

本研究通过小鼠行为绝望抑郁模型，发现柴芍中剂量组与氟西汀组可显著增加小鼠在中央区域停留时间，同时柴芍各给药组，因为剂量的差异可以不同程度的影响小鼠强迫游泳和悬尾不动时间，且各组对比空白对照组差异均有统计学意义，这提示柴芍提取液具有较好的抗抑郁效果。柴芍高、中、低剂量组与氟西汀组比较差异无统计学意义，表明利用中药调节抑郁样情绪与西药有着相似的效果，利用柴胡和白芍配伍的中药制剂治疗与抑郁样情绪相关的疾病发展前景相对良好。本研究发现柴芍提取液对小鼠的抑郁样行为具有明显的改善作用，为继续深入研究柴芍提取液的抗抑郁作用提供了有力的支持。也为将柴胡配伍白芍发展成疗效明确，质量可控，作用机制确切的抗抑郁新药奠定了良好的基础。