HPLC测定水飞蓟宾缓释纳米球的体外释放度

梅康康，胡容峰

（1.安徽省儿童医院，安徽 合肥 230051；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012）

水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟果实中提取分离得到的有效成分，临床主要用于治疗急慢性肝炎、各种肝损伤、肝纤维化和早期肝硬化等[1-2]。水飞蓟宾疗效好、毒性低，但水飞蓟宾属二氢黄酮醇类化合物，难溶于水，口服生物利用度低，极大地限制了其临床疗效[3-4]。已有研究者制备了具有生物可降解性的静脉注射缓释纳米球制剂，以期达到在提高水飞蓟宾的体外溶出和体内吸收的同时，具备良好的肝靶向性的目的[5-6]。本研究建立了水飞蓟宾缓释纳米球体外释放过程中的含量测定方法，可为其体外研究提供有效的质量控制手段。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AG285型电子天平（瑞典Mettler Toledo公司）；79-1型磁力搅拌器（江苏金坛环宇科学仪器厂）；超滤离心管（截留分子量为3000，美国Millipore公司）；高效液相色谱仪（包括LC-20AB泵，SPD-M20A紫外检测器及岛津LCsolution色谱工作站，日本岛津）；C18色谱柱（依利特，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 试药

水飞蓟宾对照品（江苏先声汉合制药，纯度99.94 %，批号：012308）；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，LA/GA=75/25，MW=8600，合肥工业大学控释药物研究室，批号：071219）；泊洛沙姆（Lutrol®F68，德国BASF公司，批号：0401278）；水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液（安徽中医药大学药学院，批号：080615）；甲醇为色谱纯，丙酮等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 溶剂的确定 取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液及空白胶体溶液，分别加入不同种类和比例的溶剂进行考察。经试验优选的方法为：取胶体溶液适量，加入两倍体积的乙腈，溶解后用流动相稀释定容即可。

2.1.2 色谱条件 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 3.0）配制：称取磷酸二氢钾6.8 g，加水900 ml，用稀磷酸调pH至3.0，用水稀释至1000 ml。流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 3.0）（49:51）；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：288 nm；进样量：20 μl。在此色谱条件下，水飞蓟宾分离得到水飞蓟宾a和水飞蓟宾b两个峰，两峰均达到基线分离。空白、空白加对照品及样品色谱图见图1。

图1 专属性色谱图

2.1.3 标准曲线 精密称取水飞蓟宾对照品12.5 mg，置入50 ml量瓶，用甲醇溶解、稀释并定容，作为储备液。然后精密吸取不同体积的储备液，用流动相稀释成0.125，1.25，12.5，25，50，100 μg/ml的系列标准溶液，分别取20 μl进样，在上述色谱条件下进样测定，结果在0.125～100 μg/ml浓度范围内，峰面积（A）与药物浓度（C）有良好的线性关系，回归方程为A=27 593C+1423.1，r=0.9999。

2.1.4 检测限和定量限 精密称取水飞蓟宾对照品，用甲醇溶解并用流动相稀释得到10.0 ng/ml的溶液，按2.1.2项色谱条件测定，得到水飞蓟宾的峰高约为基线噪音的10倍。再精密量取该溶液2 ml，置入10 ml量瓶，流动相稀释至刻度，得到水飞蓟宾的峰高约为基线噪音的3倍。结果表明，水飞蓟宾在该色谱条件下的检测限为2.0 ng/ml，定量限为10 ng/ml。

2.1.5 精密度

2.1.5.1 日内精密度 精密吸取2.1.3项下1.25 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，按2.1.2项色谱条件测定，同天连续进样5次，结果峰面积平均值为33 586.556，RSD为1.14 %，结果表明，仪器精密度良好。

2.1.5.2 日间精密度 精密吸取2.1.3项下1.25 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，按2.1.2项色谱条件测定，隔天进样1次，共5 d，结果峰面积平均值为33 719.125，RSD为1.31 %，结果表明，该方法精密度良好。

2.1.6 重复性 取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液适量，加入两倍体积的乙腈，溶解后用流动相稀释并定容，平行制备5份供试品溶液，按2.1.2项色谱条件测定，水飞蓟宾含量的平均值为0.99 mg/ml，RSD为1.29 %，结果表明，该方法重复性良好。

2.1.7 回收率 取空白缓释纳米球胶体溶液适量，用两倍体积的乙腈溶解，分别精密加入适量的对照品溶液，流动相稀释并定容，按2.1.2项色谱条件测定，结果水飞蓟宾的平均回收率为99.95 %，RSD为0.25 %（n=9），表明该方法测定结果准确，符合要求。结果见表1。

表1 回收率结果

2.1.8 溶液稳定性 精密吸取2.1.3项下12.5 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，分别于0，3，6，9，12，24 h，按2.1.2项色谱条件测定，按水飞蓟宾峰面积计算RSD为0.38 %；另取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液适量，乙腈溶解后使用流动相稀释定容，同法测定RSD为0.52 %。结果表明，溶液稳定性良好。

2.1.9 耐用性 精密吸取2.1.3项下25 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，分别调整缓冲液的pH值、流动相中甲醇和缓冲液的比例、流速等条件，同法测定，考察水飞蓟宾a峰和水飞蓟宾b峰之间的分离度。结果表明，水飞蓟宾a和水飞蓟宾b完全分离，该法耐用性好。

2.1.10 包封率及载药量 取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液置超滤离心管中，低温离心（4 ℃，12 000 r/min）10 min[7-8]。精密吸取滤液适量，HPLC测定水飞蓟宾的含量，计算未包封水飞蓟宾的量（M1）。另精密吸取一定量的水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液置入量瓶，加入2两倍体积的乙腈溶解水飞蓟宾和PLGA，流动相稀释并定容，测定水飞蓟宾的含量，计算胶体溶液中的水飞蓟宾量（M2）。MPLGA为PLGA的投料量。按下式计算包封率，载药量和药物利用率[9]。

2.1.11 超滤膜的吸附性评价 采用超滤离心法测定纳米粒包封率的先决条件是药物不被超滤膜吸附，因此，试验考察了超滤离心管中超滤膜对药物的吸附性。精密量取对照品贮备液，用水稀释成高、中、低3种浓度，各取0.5 ml，置入超滤离心管，离心（4 ℃，12 000 r/min）10 min，HPLC测定滤液的峰面积，以下式计算回收率，结果见表2。说明超滤膜对水飞蓟宾无吸附，可用于水飞蓟宾缓释纳米球包封率的测定。回收率（%）=（滤液峰面积/母液峰面积）×100 %

表2 以回收率评价离心超滤管对药物的吸附性

2.2 释放度测定

2.2.1 释放度方法 精密量取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液适量，加入溶出介质分散后，置入透析袋，两端扎紧，投入内盛100 ml溶出介质（pH 7.4磷酸盐缓冲液）溶出杯中，37±0.5 ℃，60 r/min恒速搅拌，于一定时间点吸取1 ml释放液，同时补加1 ml溶出介质。所取样过0.45 μm滤膜，测定水飞蓟宾浓度，以各时间点的实测药物浓度与按标示量计算得到的100 ml溶出介质中的药物浓度之比，计算累积释放百分数Q（%）[10]。

2.2.2 溶出介质的选择 药物从水飞蓟宾缓释纳米球内部的释放需伴随PLGA的降解，因此其释药速度与PLGA在介质中的降解速度有关。PLGA为乳酸和羟基乙醇酸经聚合而成的高分子材料，其水解受溶液pH影响较大，因此溶液pH可影响水飞蓟宾缓释纳米球中药物的释放。人体组织pH约7.4，故为更好地模拟体内水飞蓟宾缓释纳米球释药情况，选择pH 7.4磷酸盐缓冲液为水飞蓟宾缓释纳米球体外释药规律研究的溶出介质。

2.2.3 色谱条件 流动相：甲醇：0.05 mo/L磷酸盐缓冲液（pH 3.0）（49:51）；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μl；检测波长：288 nm。在此色谱条件下，水飞蓟宾分离得到水飞蓟宾a和水飞蓟宾b两个峰，两峰均达到基线分离。空白、空白加对照品及样品色谱图见图2。

图2 专属性色图谱

2.2.4 标准曲线 精密称取水飞蓟宾对照品12.5 mg，置入50 ml量瓶，用适量甲醇溶解、溶出介质稀释并定容，作为储备液。然后精密吸取不同体积的储备液，溶出介质稀释成0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg/ml的标准溶液，分别取20 μl进样，按2.2.3项色谱条件测定，结果在0.5～20.0 μg/ml浓度范围内，峰面积（A）与药物浓度（C）有良好的线性关系，回归方程为A=30 618C-2085.8，r=0.9999。

2.2.5 检测限和定量限 精密称取水飞蓟宾对照品，用适量甲醇溶解并用溶出介质稀释得到15.0 ng/ml的溶液，按2.2.3项色谱条件测定，得到水飞蓟宾的峰高约为基线噪音的10倍。再精密量取该溶液2 ml，置入10 ml量瓶，溶出介质稀释至刻度，得到水飞蓟宾的峰高约为基线噪音的3倍。结果表明，水飞蓟宾在该色谱条件下的检测限为3.0 ng/ml，定量限为15 ng/ml。

2.2.6 精密度

2.2.6.1 日内精密度 精密吸取2.2.4项下浓度为5.0 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，按2.2.3项色谱条件测定，同天连续进样5次，按峰面积计算RSD为1.08 %，结果表明，仪器精密度良好。

2.2.6.2 日间精密度 精密吸取2.2.4项下浓度为5.0 μg/ml水飞蓟宾标准溶液，按2.2.3项色谱条件测定，隔天进样1次，共5 d，按峰面积计算RSD为1.26 %，结果表明，该方法精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液适量，按2.2.1项释放度测定方法，在相同取样时间点，平行制备5份供试品溶液，按2.2.3项色谱条件测定，释放液中水飞蓟宾含量的平均值为4.6 μg/ml，RSD为1.42 %，结果表明，该方法重复性良好。

2.2.8 回收率 精密量取2.2.4项下0.5 μg/ml标准溶液1.0 ml，加入适量的对照品溶液，溶出介质稀释定容后，按2.2.3项色谱条件测定，结果水飞蓟宾的平均回收率为101.85 %，RSD为1.53 %（n=9），表明该方法测定结果准确，符合要求。结果见表3。

表3 回收率测定结果

2.2.9 溶液稳定性 精密称取水飞蓟宾适量，甲醇溶解后并用溶出介质配制成浓度约1.0 μg/ml溶液，置37 ℃水浴中，于0，3，6，9，12，24 h，按2.2.3项色谱条件测定，按水飞蓟宾峰面积计算RSD为0.34 %，结果表明，水飞蓟宾在37 ℃溶出介质中24 h内稳定。

2.2.10 耐用性 取2.2.4项下10 μg/ml标准溶液，分别调整缓冲液的pH值、流动相中甲醇和缓冲液的比例、流速等条件，同法测定，考察水飞蓟宾a峰和水飞蓟宾b峰之间的分离度。结果表明，水飞蓟宾a和水飞蓟宾b完全分离，该法耐用性好。

3 讨论

水飞蓟宾缓释纳米球体外含量测定选择HPLC而没有选择紫外分光光度法，是考虑到水飞蓟宾缓释纳米球制剂中，样品药物浓度较低，紫外分光光度法无法满足检测要求；另外预试验中扫描空白辅料的紫外图谱，发现在药物吸收峰处有吸收；因此，水飞蓟宾缓释纳米球制剂的体外分析方法选择了HPLC。

水飞蓟宾缓释纳米球中药物的测定方法不同于水飞蓟宾溶液，需要将纳米球溶解，药物才能释放出来。选择合适的溶剂系统，聚合物和药物可同时溶解，聚合物不干扰主药的测定，试样中的主成份与辅料不经过分离，溶液中的药物浓度即可直接测定。另外，载药纳米球胶体溶液中，除被包裹或吸附于纳米球的药物外，在胶体溶液中可能还含有少量的游离药物。最后，根据水飞蓟宾、PLGA和附加剂的性质，选择乙腈作为溶剂，HPLC法测定水飞蓟宾缓释纳米球胶体溶液中水飞蓟宾的含量，辅料峰不干扰水飞蓟宾的测定，所得方法专属性强，精密度高。

天然或合成的水飞蓟宾并非单一化合物，而是一对同分异构体（水飞蓟宾a和水飞蓟宾b）的混合物，且它们都具有药理活性，为了便于计算，故将水飞蓟宾a和水飞蓟宾b两个峰的峰面积之和作为定量用。关于载药量的计算，采用包裹的药物重量与载体投料重量之比来计算，更直观的体现了PLGA对药物的包裹能力，便于纳米球制备工艺中考察PLGA载药的能力。

在测定游离药物时，考察了离心超滤管中滤膜对药物的吸附性，结果显示药物不被超滤膜吸附。而采用常规冷冻超速离心来进行游离药物的测定时，发现所测的包封率比超滤离心法要小，推测是离心时转速不够，未能形成足够大的离心力使所有纳米球都能沉淀下来。采用透析法测定游离药物时，由于水飞蓟宾难溶于水，所需时间较长，不利于样品的快速检测。因此，最后选择超滤离心法。