大鼠血浆中桑色素的浓度测定及其药动学研究

柳 佳，姚庆强，邓志鹏

（1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南250200；2.山东省医学科学院 药物研究所，山东 济南250062；3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东 济南250062；4.山东省罕少见病重点实验室，山东 济南250062）

桑白皮为桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥根皮，是一味传统中草药，主要分布于我国安徽、河南、河北、湖南、四川、广东等地，具有泻肺平喘，利水消肿的功效[1]。现研究表明，桑白皮具有镇咳平喘[2]、抗炎[3]、降血糖[4-5]和降血脂[6]的作用。桑白皮的化学成分繁多，主要包括黄酮类化合物、芪类化合物、Diels-Alder型加合物和多糖类化合物等[7]。桑色素（morin）是从桑白皮（Mori cortex）中分离得到的黄酮类化合物[8]。近年，实验发现桑色素具有抗癌、抗高尿酸血症和消炎作用[9]，但尚未有关于桑色素的药动学研究。本文建立了一种快速、高灵敏度、高选择性的超高效液相色谱-质谱联用方法（UPLC-MS/MS）测定桑色素在大鼠血浆中的浓度，并将其应用于大鼠体内的药动学研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Shimadzu Prominence 超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB SCIEX Q-TRAP 5500 型质谱仪，包括电喷雾离子源（ESI），Analyst®1.6.3数据采集和处理系统（美国 AB SCIEX 公司）；EVA50A型多功能样品浓缩仪（北京普利泰科仪器公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷冻离心机（赛默飞世尔）；EL204电子天平（梅特勒-托利多）；IKA Vortex天才3旋涡混匀器（广州艾卡仪器设备公司）。

1.2 试剂

桑色素标准品（批号：HMO52276198，纯度：98.87 %，宝鸡辰光）；芫花素标准品（内标物质，纯度：94.2 % ，中国食品药品检定研究院）；丙二醇（分析纯，批号：20170901，南京威尔药业）；甲醇（色谱纯，批号：18075174，美国TEDIA公司）；乙腈（色谱纯，批号：164791，赛默飞世尔）；甲酸为（色谱纯级别，天津科密欧）；实验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

5只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200±20 g，购自济南朋悦动物繁育公司，许可证号为SCXK（鲁）20140007。实验期间大鼠在恒定环境下饲养，饲养温度为23±3 ℃，相对湿度为55 %±15 %，自由饮食饮水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及质谱条件

2.1.1 色谱条件 采用Thermo Hypersil GOLD-C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）色谱柱对待测样品和内标化合物进行分离，流动相为0.1 % 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序为：0～2.5 min，70 % B→90 % B；2.5～2.6 min，90 % B→7 %B；2.6～5.0 min，70 % B；流速设定为0.5 ml/min，柱温设为40 ℃，自动进样器温度为15 ℃，进样量2 μl。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源，选用负离子检测方式，扫描方式为多反应监测（MRM）。气帘气（CUR）设定为35 psi，碰撞气设为medium，离子源喷雾电压（IS）设为-4500 V，离子源温度（TEM）设为 550 ℃，雾化气压力（Gas 1）设为 55 psi，加热气压力（Gas 2）设定为55 psi。通过切换阀的切换， 每次运行仅记录1.0～5.0 min 的MS/MS 数据。桑色素和内标的定量离子分别为m/z300.9→151.2和m/z283.1→268.2，同时将m/z300.9→125.1作为桑色素的定性离子对。桑色素和芫花素的二级MS图谱见图1。

图1 桑色素和芫花素的MS图谱

2.2 溶液的制备

2.2.1 大鼠灌胃溶液的配制 精密称取桑色素标准品4.41 mg，加丙二醇10 ml，超声，然后边涡流边缓慢滴加10 ml水，得到桑色素单体的大鼠灌胃溶液（浓度为218.01 μg/ml）。

2.2.2 标准溶液的配制 精密称取桑色素标准品5.10 mg，用甲醇1 ml溶解，配制成5.10 mg/ml的储备溶液，-80 ℃贮存。临用前先超声，再用乙腈逐步稀释获得系列标准溶液后待用。精密称取芫花素标准品2.88 mg，加入甲醇6 ml，超声溶解，并用乙腈逐步稀释成浓度为50 ng/ml的内标工作溶液。

2.3 血浆样品的处理方法

取50 μl内标溶液，置入1.5 ml EP管,依次加入50 μl血浆样品和100 μl乙腈，涡旋振荡5 min，6 ℃条件下以13 000 r/min的转速离心5 min，取上清进样，进样量2 μl。

2.4 方法学验证

参照FDA[10]和中国药典2015版的指导原则[11]，对本文建立的UPLC-MS/MS方法进行方法学验证，包括选择性、标准曲线、精密度和准确度、提取回收率、基质效应和稳定性等。

2.4.1 选择性 分别取6份来自不同批次的大鼠空白血浆样品、含桑色素和内标的标准血浆样品及给药10 min后的大鼠血浆样品进行 UPLC-MS/MS 分析。结果显示，空白血浆中无内源性杂质干扰，桑色素和内标化合物的峰形良好且互不干扰，保留时间分别为1.33，1.68 min。在高浓度样品之后测定大鼠空白血浆样品，其残留不影响桑色素和内标的含量测定。

2.4.2 标准曲线 将桑色素的储备溶液用乙腈逐步稀释成浓度为20.2，40.3，100.8，403.4，1008.4，4033.6，10084 ng/ml的系列对照品溶液。取对照品溶液10 μl，加入190 μl大鼠空白血浆，最终得到浓度分别为1.01，2.02，5.04，20.2，50.4，201.7，504.2 ng/ml的对照血浆样品溶液。按2.3项方法处理上述血浆样品后进行UPLC-MS/MS分析，连续测定3 d，记录峰面积。以桑色素的浓度（ng/ml）作为横坐标（x），桑色素峰面积和内标峰面积的比值作为纵坐标（y），权重因子采用1/X2进行线性回归分析，得到桑色素的线性回归方程，其回归方程为y=1.46×10-3x+2.82×10-3（r=0.9953），线性范围为1.01～504.2 ng/ml，定量下限为1.01 ng/ml，其精密度RSD≤7.24 %，RE≤-1.19 %，满足生物样品测定的方法学要求。

2.4.3 精密度与准确度 将桑色素的储备溶液用乙腈逐步稀释，得到低、中、高浓度的质控样品溶液，桑色素的浓度分别为40.4，606，8068 ng/ml。取10 μl质控样品溶液，加入190 μl大鼠空白血浆，涡旋振荡并离心，最终得到血浆浓度为2.02，30.3，403.4 ng/ml的质控血浆样品。将质控血浆样品按2.3项方法处理并进样分析（每个浓度进样5次，连续测定3 d），计算同一浓度下的精密度和准确度，得到日内精密度RSD≤9.04%，RE≤10.06 %；连续测定3 d，其日间精密度RSD≤6.10 %，RE≤10.40 %。

2.4.4 提取回收率和基质效应 取50 μl内标溶液，依次加入50 μl低、中、高3个浓度的质控血浆样品溶液和100 μl乙腈（重复6份），按2.3项方法处理，取上清进样分析，记录桑色素及内标的峰面积（Am，AIS）；另取50 μl空白血浆，加入150 μl乙腈，涡流混合5 min，13 000 r/min离心5 min，取全部上清，氮气吹干，用 50 μl内标溶液和50 μl桑色素溶液（浓度分别为2.02，30.3，403.4 ng/ml）对其进行复溶（重复6份），涡流混合后进行UPLCMS/MS分析，记录桑色素及内标的峰面积（Bm，BIS）。桑色素和内标的回收率用峰面积之比A/B计算。桑色素的回收率为85.3 %～92.9 %，内标的回收率为91.2 %。另取50 μl纯水和150 μl乙腈，涡流混合后经氮气吹干，再加入50 μl内标溶液和50 μl桑色素溶液（浓度为2.02，30.3，403.4 ng/ml），按2.3项方法处理，平行测定6份，记录桑色素和内标的峰面积（Cm，CIS）。分别以峰面积的比值B/C计算桑色素和内标的基质效应。桑色素的基质效应为91.6 % ～ 105.9 %，内标为103.1 %。由结果可见，大鼠血浆中的基质对桑色素的离子作用很微弱，不影响结果的准确性，可忽略。

2.4.5 稳定性试验 桑色素分别于-80 ℃放置7 d、-80 ℃反复冻融3次、室温放置6 h、自动进样器（15℃）中放置12 h。按2.3项方法处理后进行UPLCMS/MS分析，平行测定3次。结果RSD≤15 %，RE≤15 %，表明桑色素在上述4种环境下均保持稳定。

2.5 大鼠药动学研究及结果

大鼠按2.186 mg/kg灌胃给药，给药前禁食12 h，自由饮水。分别在给药后0.083，0.167，0.5，0.75，1，1.5，2，3，5，8，12，24 h于眼底静脉丛取血约300 μl，置入肝素化的EP管，13 000 r/min离心3 min，取上层血浆,置-80 ℃保存待测。

按2.1项条件，采用UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中桑色素的浓度，采用DAS2.1.1软件进行拟合，得到血药浓度-时间曲线（见图2）和主要的药动学参数（见表1）。大鼠灌胃给予桑色素单体后，药-时曲线下面积（AUC0-∞）为375.8±265.7 μg/L·h，消除半衰期（t1/2z）为3.27±1.26 h，达峰时间（Tmax）为0.167±0.00 h，药峰浓度（Cmax）为234.2±45.8 μg/L。

图2 大鼠体内桑色素的血药浓度-时间曲线（n=5）

3 讨论

本实验比较了桑色素在水-甲醇、水-乙腈、0.1 % 甲酸水溶液-乙腈及含10 mmol/L乙酸铵的0.1 % 甲酸水溶液-乙腈4种流动相条件下的分离效果，流动相为0.1 % 甲酸水溶液-乙腈时桑色素和内标的分离效果最好。通过比较桑色素在ESI下正、负两种离子的检测方式，发现桑色素在负离子模式下的响应明显高于正离子，所以本实验选择在负离子检测方式下进行。在负离子检测模式下，对桑色素进行二级MS分析，得到桑色素的主要碎片离子为m/z300.9→151.2和m/z300.9→125.1，内标的主要碎片离子为m/z283.1→268.2。分别将m/z300.9→151.2，m/z283.1→268.2作为桑色素和内标的定量离子，同时采用m/z300.9→125.1对桑色素进行定性分析。在负离子条件下对桑色素和内标的各质谱参数进行优化。结果如下：桑色素的去簇电压（DP）、射入电压（EP）、碰撞室射出电压（CXP）、碰撞能（CE）分别为50 V，15 V，15 V和 28 V，内标的去簇电压（DP）、射入电压（EP）、碰撞室射出电压（CXP）、碰撞能（CE）分别为65 V，15 V，50 V和32 V。

表1 桑色素的主要药动学参数（±s，n=5）

表1 桑色素的主要药动学参数（±s，n=5）

药动学参数桑色素AUC0-t/μg·(L·h)-1361.2±261.7 AUC0-∞/μg·(L·h)-1375.8±265.7 MRT0-t/h2.48±1.23 MRT0-∞/h3.11±1.29 t1/2z/h3.27±1.26 Tmax/h 0.167±0.00 CL/L·(h·kg)-1 7.636±3.41 Vd/L·kg-133.0±16.5 Cmax/μg·L-1 234.2±45.8

4 结论

本实验考察了SD大鼠灌胃给予桑色素单体后的药动学性质，结果表明，桑色素在大鼠体内呈非线性动力学特征，且其在大鼠体内吸收速度较快，大鼠灌胃给药0.167 h即达血药峰浓度（Cmax）。本文建立了一种测定大鼠血浆中桑色素浓度的UPLCMS/MS方法，该方法操作简便、前处理简单、稳定性良好且回收率较高，可用于生物样品中桑色素含量的测定，为桑色素的进一步研究提供帮助和支持。