高效液相色谱法测定半胱胺螯合锌的含量

张倩云 赵威 徐振兴 吴月敏 姜燕萍 卢立志 李浙烽 徐二华

（1，杭州康德权饲料有限公司，包膜饲料添加剂省级重点企业研究院 311107；2，浙江省农业科学院畜牧兽医研究所 320021）

半胱胺螯合锌是一种新型的饲料添加剂[1]，分子式为[H2NCH2CH2S]2Zn[2]，分子量为217.68，该产品具有化学性质稳定、生物学效价高、适口性好，降低环境污染等优势，半胱胺螯合锌的合成与在猪上面的生产应用有文献报道[1，2]，但没有含量检测方法的报道，本研究建立了高效液相色谱法测定半胱胺螯合锌含量的方法，为半胱胺螯合锌质量标准的建立和产品质量控制提供依据。

1 仪器与试药

赛默飞U3000 高效液相色谱仪（备有紫外检测器），变色龙6.8 色谱工作站。

半胱胺盐酸盐对照品（sigma，批号WXBC1602V），半胱胺螯合锌样品为杭州康德权饲料有限公司提供，批号为181226，190108，190110。

2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：Agela Technologies，Venusil MP C18 （ 4.6 ×150mm，5um）；流动相：乙腈：0.017mol/L 庚烷磺酸钠溶液（取1.7g 庚烷磺酸钠置于500ml 量瓶中，加入0.1mlH3PO4，然后用纯水稀释并定容至刻度）=15:85，进样量5ul，检测波长214nm；流速1ml/min。此色谱条件下，由半胱胺盐酸盐对照品溶液和供试品溶液分析可知，出峰时间一致，均为4.0min，且溶剂无干扰。

在上述色谱条件下分别取对照品溶液、供试品溶液和溶剂溶液各5ul 进样分析，结果表明，理论板数按半胱胺计算不低于4000，色谱峰分离度良好，对照品、样品和溶剂色谱图见图1。

3 方法与结果

3.1 溶液制备

对照品溶液：精密称取对照品半胱胺盐酸盐1.5g，置100ml 量瓶中，加超纯水约20ml 溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀，制每1ml 约含半胱胺10mg 的对照品溶液。

供试品溶液：称取样品约0.5g，精密称定，置于100ml 容量瓶中，加盐酸1+1 溶液0.5ml，加超纯水约50ml，置于100℃沸水浴中水浴20min，取出放冷至室温，加超纯水定容至刻度，摇匀，备用。

溶剂溶液：取盐酸1+1 溶液0.5ml，加超纯水约50ml，置于100ml 量瓶中，加超纯水定容至刻度。

3.2 线性关系考察

图1 对照品（A）、样品（B）、溶剂（C）液相色谱图

分别精密量取半胱胺盐酸盐对照品溶液0.30，0.50，1.00，2.00，3.00ml，分别置10ml 量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，分别得半胱胺浓度为0.306，0.510，1.021，2.042，3.063mg/ml 的溶液，分别进样5ul 测定。以对照品溶液浓度（X，mg/ml）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，半胱胺回归曲线方程为：Y=10.739X+0.3834 r2=0.9999，半胱胺在0.306～3.063mg/ml 范围内，与峰面积成良好线性关系。

3.3 精密度试验

取对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6 次，峰面积的RSD 结果为：0.89%。

3.4 重复性试验

取同一批号的半胱胺螯合锌6 份，批号为190110，每份取粉末约0.5g，精密称定，按3.1 项下的方法操作。在上述色谱条件下进样分析，计算半胱胺螯合锌的平均含量为26.26%，RSD 为0.43%，重复性良好。

3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，6，8，12h，在上述色谱条件下进样分析，计算半胱胺螯合锌峰面积的RSD 为0.50%，结果表明，供试品溶液在12h 内稳定性良好。

3.6 回收率试验

取已知含量的半胱胺螯合锌9 份，批号为190110，每份取粉末约0.5g，精密称定，分别精密加入低、中、高3 种浓度的对照品溶液，同上法操作，在上述色谱条件下分析，计算平均回收率。加样回收率测定结果见表1。

3.7 样品测定

精密称取半胱胺螯合锌样品约0.5g，置于100ml 量瓶中，按3.1 项下的方法操作，在上述色谱条件下对3 批次半胱胺螯合锌进行分析，计算含量，结果见表2。

3.8 检出限与定量限

取半胱胺盐酸盐对照品适量，加超纯水溶解并稀释制成一系列浓度的溶液，取5ul 注入液相色谱仪，测得半胱胺盐酸盐（以半胱胺螯合锌计算）最小检出限为0.15ng （S/N≥3），定量限为0.45ng （S/N≥10）。

4 讨论

4.1 流动相和波长的选择

半胱胺螯合锌中的活性物质为半胱胺，国家标准有关于饲料添加剂半胱胺盐酸盐的测定[3]，采用液相色谱法，故首先按照国家标准的流动相配置和仪器参数设置，测定半胱胺螯合锌的样品时，加50%甲醇水溶解，上机测定，在与对照品溶液主峰的保留时间相同的位置上，样品也出峰，说明半胱胺活性成分被检出。

表1 回收率试验结果

表2 25%半胱胺螯合锌含量测定结果（n=3）

4.2 溶剂的选择

样品溶剂首先选用的是国标要求的50%甲醇水，初始的3～5 个样品峰型比较对称，但峰面积不稳定，忽高忽低，且随着样品重复进样数量加大，主峰色谱图会形成严重的前延或拖尾峰，无法对主成分半胱胺进行定性定量，可能的原因为半胱胺螯合锌直接溶于水后形成动态的解离，导致色谱柱分离效果变差。为了解决样品动态解离问题，将溶解样品的溶剂改成纯水，并加入稍微过量的盐酸1+1 溶液，使得样品溶液为弱酸性，防止半胱胺螯合锌的逆解离，影响色谱峰的面积和峰型，经过实验，加入0.5ml 盐酸1+1 溶液作为溶剂的样品色谱图峰型峰面积均稳定。

半胱胺盐酸盐的检测目前有液相法，碘液滴定法[4]，本文献研究物质为半胱胺螯合锌，该方法检测活性物质半胱胺，在酸性条件下经过解离成为半胱胺后，用半胱胺盐酸盐作为对照品测定含量。本研究建立了高效液相色谱法测定半胱胺螯合锌的分析方法，使用的溶剂为水和盐酸1+1 溶液，方法快速、准确、重复性好，可为半胱胺螯合锌的质量控制方法。