Apelin receptor(APJ)拮抗剂F13A对小鼠抑郁样行为的影响及起效时间*

于旭东, 刘君宇, 肖志勇, 田绍文 △

(1. 邵阳学院生理学教研室, 湖南 邵阳 422000; 2. 南华大学生理学教研室，湖南 衡阳 421001； 3. 南华大学附属第一医院， 湖南 衡阳 421001)

抑郁症是世界范围内导致残疾的主要原因之一，给患者及其家属带来重大的精神和经济负担[1,2]。以选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)为代表的一线抗抑郁药物常需要3～6周的治疗才见效，并且对大约三分之一的抑郁症患者没有作用。最近，发现氯胺酮(一种非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)拮抗剂)单次给药能快速缓解抑郁症状并且其作用可持续数天[3]。但氯胺酮存在药物成瘾、损害认知等副作用，因此寻找新型、低毒、快速起效的抗抑郁药物及药物作用靶点一直是一个巨大的挑战。

Apelin及其受体(apelin receptor，APJ)广泛分布于中枢神经系统，尤其是海马和下丘脑。提示其在学习记忆，应激调节以及抑郁症中具有重要作用[4]。外源性给予APJ受体激动剂apelin-13可损害被动回避任务、场景恐惧和新颖物体识别任务中啮齿类学习记忆。然而，APJ受体激动剂可改善急性应激、慢性应激、以及脂多糖注射引起的记忆损害。此外，apelin-13可在强迫游泳测试、习得性无助测试、重复束缚浸水应激抑郁模型、慢性社会挫败抑郁模型中发挥抗抑郁样作用[5, 6]，而抑制APJ受体对抑郁样行为的影响并不可知。

APJ受体拮抗剂F13A是由13个氨基酸组成的多肽，与apelin-13相比仅有最后一个氨基酸不同，其可与apelin竞争性结合APJ受体，但无生物学活性。强迫游泳测试是一种普遍接受用于预测药物抗抑郁作用的行为学范式，在实验一开始啮齿类努力攀爬、游泳试图逃离水桶。然而多次失败后，啮齿类就会出现四肢静止不动，漂浮于水面之上的 “绝望”行为。本文基于强迫游泳范式拟探索APJ受体拮抗剂F13A对小鼠抑郁样行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性昆明小鼠(35～40 g)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，小鼠单笼饲养，自由摄水摄食，放置于恒温25℃、恒定的12 h光照/黑暗循环(光照时间07:00—19:00)的鼠房中。行为学前连续5 d抚摸小鼠每天3 min，以适应环境和实验操作者。所有实验程序均经南华大学实验动物使用委员会批准，并完全按照美国国家卫生研究院关于和使用实验室动物的指南进行。

1.2 实验设计

实验分三批小鼠进行，第一批小鼠随机分成对照组(Control)，F13A组(F13A)和氯胺酮组(ketamine)，每组9只，其中对照组小鼠腹腔注射生理盐水(10 ml/kg，ip)+侧脑室注射生理盐水(1μl，i.c.v)，F13A组小鼠腹腔注射生理盐水(10 ml/kg，ip)+侧脑室注射F13A(1μl，i.c.v)，氯胺酮组小鼠腹腔注射氯胺酮(10 ml/kg，ip)+侧脑室注射生理盐水(1μl/只，i.c.v)，30 min后进行第一次强迫游泳测试(forced swimming test 1，FST1)，FST1后24 h进行第二次强迫游泳测试(forced swimming test 2，FST2)。为排除活动度对实验结果的影响，第二批小鼠随机分为对照组，F13A组和氯胺酮组，每组9只，药物注射和第一批小鼠相同，注射后30 min进行第一次自发活动测试(locomotor activity test 1，LMT1)，LMT1前24 h进行自发活动习惯化，LMT1后24 h进行第二次自发活动测试(locomotor activity test 2，LMT2)。第三批小鼠随机分为对照组，F13A组和氯胺酮组，每组9只，药物注射和第一批小鼠相同，注射后30 min进行FST1，FST1前24 h进行强迫游泳应激(forced swimming stress，FSS)FST1后24 h进行第二次强迫游泳测试FST2(图1)。

Fig.1Schematic of the experimental design

FSS: Forced swimming stress pretreatment; FST1: Forced swimming test 1; FST2: Forced swimming test 2

1.3 强迫游泳程序

强迫游泳程序分为应激预处理(第一日)和强迫游泳测试(第二日、第三日)两个阶段，在应激预处理(FSS)阶段，小鼠放入装有15 cm水(23±1)℃的透明有机玻璃圆筒(高30 cm，直径20 cm)中进行15 min游泳，有机玻璃圆桶放入隔音箱(800 Lux)。在强迫游泳测试(forced swimming test，FST)阶段，小鼠再次放入条件相同有机玻璃桶内，连续2 d，每天6 min。隔音箱内数码摄像机记录小鼠各阶段行为。由受过训练的观察者双盲统计小鼠在6 min测试中最后4 min的不动行为，并用秒表记录小鼠不动行为持续的时间。动物除了保持头部高于水面所需的运动外无额外运动即为不动。

1.4 自发活动测试

自发活动测试在自发活动测试箱(45 cm×45 cm×60 cm)中进行，自发活动测试箱内光照强度200 Lux，噪声65 dB，箱顶一摄像头记录小鼠行为，箱底平均分割成36个正方形方格(7.5 cm×7.5 cm)。自发活动测试包括习惯化和测试两个阶段，在第一日进行习惯化阶段，小鼠放入测试箱中，自由活动15 min后将小鼠放回鼠笼，清除测试箱内粪便并用75%酒精擦拭清除遗留气味以免干扰下一只小鼠的行为。第二日和第三日进行测试阶段(LMT1和LMT2)，在这两天分别将小鼠放入测试箱中自由活动6 min。摄像头记录测试阶段小鼠的行为，熟练者双盲统计小鼠穿越的格子数以此判断小鼠的活动度，小鼠穿过的网格越多小鼠的活动度越强。

1.5 侧脑室置管及微量给药

小鼠腹腔注射水合氯醛(5%，0.1 ml/10 g)，待麻醉后，固定于脑立体定位仪上。用酒精棉球擦拭小鼠头部，剪去头部毛发与皮肤，暴露其颅骨，采用40%过氧化氢溶液刮净颅骨表面组织并止血，暴露颅骨前囟点。每只小鼠右侧侧脑室植入无菌导管(62003型，瑞沃德生命科学有限公司，中国深圳)，小鼠侧脑室微注射坐标以前囟为原点，向后0.3 mm，右旁开1.0 mm进行颅骨水平面定位，并用钻头钻孔。埋植导管以前囟点为原点向下2.5 mm，套管用三颗不锈钢螺钉和牙科水泥固定在颅骨上，术后小鼠单笼饲养恢复5～7 d。侧脑室微量注射在动物清醒状态(用毛巾轻微束缚)下进行，用微量注射泵通过引导管向侧脑室注射F13A(每只6 μg/μl)或生理盐水(每只1μl)，注射速度为1 μl/2 min. 实验完成后，通过组织学检查套管的位置，并剔除导管错位动物的数据。

1.6 药物

F13A (Glu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Ala)购自吉尔生化有限公司(上海)，F13A溶于生理盐水后 -80℃保存，注射时置于冰中，侧脑室注射剂量为每只6 μg[5]。盐酸氯胺酮注射液由福建古田药业有限公司生产，剂量基于之前的研究[7]，用生理盐水稀释,最终浓度为2 mg/ml，腹腔注射体积为10 ml/kg。

1.7 统计学处理

所有数据都以均值±标准误(mean±SEM)表示，使用Sigma Stat 3.5 软件进行统计学分析，实验数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 和非配对的t检验，事后分析使用Tukey HSD。

2 结果

2.1 在无FSS预处理时，F13A实施30 min对小鼠FST1及24 h后FST2的影响。

在FST1阶段(图2A)，one-way ANOVA表明，各组小鼠不动时间存在显著性差异(P<0.05)。post-hoc分析表明，氯胺酮组小鼠不动时间显著性低于对照组(P<0.01)；而F13A组小鼠不动时间与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

在LMT1阶段(图2B)，one-way ANOVA表明，各组小鼠穿越的格子数无显著性差异(P>0.05)，表明F13A不影响小鼠活动水平。

这些结果表明氯胺酮而非F13A在FST1中发挥快速起效的抗抑郁样作用。

**P<0.01vscontrol group

在FST2阶段(图3A)，one-way ANOVA表明，各组小鼠不动时间存在显著性差异(P<0.01)。post-hoc分析表明， F13A组小鼠不动时间显著性低于对照组(P<0.01 )；氯胺酮组小鼠显示出降低的趋势但没有显著性。

在LMT2阶段(图3B)，one-way ANOVA表明，各组小鼠穿越的格子数无显著性差异(P>0.05)，表明F13A不影响小鼠活动水平。

这些结果表明F13A而非氯胺酮在FST2中发挥抗抑郁样作用。

**P<0.01vscontrol group

2.2 在FSS预处理后，F13A实施30 min对小鼠FST1及24 h后FST2的影响。

造成F13A在FST1无抗抑郁样作用而在FST2发挥抗抑郁样作用的原因可能是(1)F13A抗抑郁作用在应激后起效；(2)F13A发挥抗抑郁样作用是慢性起效(24 h)而非急性起效(30 min)。为明确F13A在FST1中无抗抑郁样作用而在FST2中发挥抗抑郁样作用的原因，本文在FSS预处理后，探索F13A实施30 min对小鼠FST1及24 h后FST2的影响。

在FST1阶段(图4A)，one-way ANOVA表明，各组小鼠不动时间存在显著性差异(P=0.01)。post-hoc分析表明，氯胺酮、F13A组小鼠不动时间显著性低于对照组(P<0.01 或P<0.05 )；此外，如图2B所示，各组小鼠穿越的格子数无显著性差异(P>0.05)。这些结果表明F13A、氯胺酮在FST1中发挥抗抑郁样作用。

在FST2阶段(图4B)，one-way ANOVA表明，各组小鼠不动时间存在显著性差异(P<0.05)。post-hoc分析表明， F13A组小鼠不动时间显著性低于对照组(P<0.05)；氯胺酮组小鼠显示出降低的趋势但没有显著性差异。此外，如图3B所示，各组小鼠穿越的格子数无显著性差异(P>0.05)。这些结果表明F13A而非氯胺酮在FST2发挥抗抑郁样作用。

以上结果表明F13A发挥快速的抗抑郁样作用，并且这种作用依赖于应激预处理。

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 讨论

当前研究表明，在无强迫游泳应激预处理的情况下，在FST1中氯胺酮而非F13A具有快速起效的抗抑郁样作用；在经历过FST1后， F13A而非氯胺酮显示出抗抑郁样作用。在强迫游泳预处理后，F13A同氯胺酮一样在FST1中呈现抗抑郁样作用并且其作用可持续24 h后的FST2。

APJ受体是孤儿G蛋白偶联受体，Apelin与Apelin受体(APJ)结合，发挥其生理功能。Apelin和APJ广泛分布于中枢神经系统，包括参与下丘脑和海马等应激反应的边缘结构。最近的研究表明，外周的Apelin系统在心血管疾病、急性肺损伤、胃功能和脂肪代谢中起着重要的作用[8, 9]。在中枢神经系统，侧脑室注射Apelin调节血压，疼痛，摄食行为和垂体激素释放[10, 11]。 大量体外和体内研究也显示中枢apelin发挥神经保护作用，如中枢Apelin实施在啮齿动物中发挥抗焦虑、治疗脑缺血和抑制神经炎症的作用[12-14]。当前研究表明，侧脑室注射APJ受体拮抗剂F13A在强迫游泳测试中发挥抗抑郁样作用。然而，之前研究表明侧脑室注射APJ受体激动剂Apelin在强迫游泳测试中发挥抗抑郁样作用[6]，这与当前研究并不矛盾，强迫游泳后可上调海马内Apelin、APJ信号以及下调下丘脑内Apelin、APJ信号。海马而非下丘脑注射Apelin，可产生抗抑郁样作用[15]，提示应激诱导的海马内Apelin，APJ的上调及下丘脑内Apelin、APJ的下调是机体的适应性反应，并且侧脑室注射Apelin产生的抗抑郁样作用是通过海马而非下丘脑起作用的。除此之外，海马内注射F13A对强迫游泳测试中抑郁样行为没有影响[15]。因此侧脑室注射F13A可能促进下丘脑Apelin、APJ信号这一适应反应从而发挥抗抑郁样作用。这种脑区的特异性在其他信号分子中也存在，例如，上调BDNF发挥抗抑郁样，而BDNF受体(TrkB)拮抗剂ANA-12也发挥抗抑郁样作用[16]。除此之外，皮质酮增加可诱导啮齿类抑郁样行为，Apelin，APJ信号参与机体皮质酮的调节，侧脑室apelin注射可诱导皮质酮升高[17]，APJ受体敲除可抑制小鼠强迫游泳应激中皮质酮反应[18]。推测F13A发挥抗抑郁样作用可能与降低应激诱导的皮质酮升高有关。

许多信号的抑制剂发挥抗抑郁作用依赖于应激状态，而对正常的个体没有影响。APJ受体激动剂发挥抗抑郁作用依赖于应激，且在无应激条件下Apelin可导致焦虑样行为以及皮质酮的升高。当前研究表明，在无应激条件下，F13A在FST1中无抗抑郁样作用，而经历FST1后，F13A在FST2中显示出抗抑郁样作用。这可能是F13A抗抑郁作用在应激后起效；而在 FSS预处理后进行FST1，结果显示F13A 在FST1中发挥抗抑郁样作用，进一步说明F13A发挥抗抑郁作用依赖于应激。在无应激时，Apelin、APJ信号保持稳定，而在应激条件下，Apelin、APJ信号发生迅速变化，其中束缚应激2 h可使胃内Apelin迅速上升[19]，慢性束缚浸水应激诱导海马Apelin、APJ信号升高[20]。应激预处理导致Apelin、APJ信号的紊乱，其中海马内Apelin，APJ的上调及下丘脑内Apelin、APJ下调。推测F13A抗抑郁作用可能是通过调节应激中Apelin、APJ信号的变化发挥作用的。

目前现行抗抑郁药物起效缓慢，急需快速持久抗抑郁症药物。关于快速起效和持久起效的抗抑郁作用虽然没有明确的时间界定,但有不少研究对药物的快速抗抑郁作用进行了描述。如氯胺酮注射后30 min发挥抗抑郁样作用，越鞠醇提物灌胃后2 h发挥抗抑郁样作用[21]；也有研究描述了持久起效的抗抑郁样作用。如氯胺酮注射后其抗抑郁作用可持续到24 h后。本研究选用30 min作为快速抗抑郁的时间点，24 h作为持久抗抑郁的时间点，氯胺酮作为阳性对照。研究发现在应激条件下，F13A在FST1前30 min注射发挥抗抑郁作用，并且其抗抑郁作用持续到24 h后的FST2。然而氯胺酮在FST2中抗抑郁作用消失，这似乎与之前氯胺酮持久的抗抑郁作用矛盾。在之前的研究中氯胺酮注射后24 h直接进行行为学测试，在此之间没有应激的干扰[7, 22]。而在当前的研究中氯胺酮注射后30 min后先进行一次FST1测试， 24 h后再进行一次FST2测试。强迫游泳又作为一种强应激，可能是这种应激抵消了氯胺酮在FST2中的作用。抑郁症病人对压力敏感、抗应激能力差，这也是抑郁症容易反复的原因。F13A抗抑郁可同时拮抗给药后的强应激干扰，与氯胺酮相比具有更大的优势。

强迫游泳测试可用于预测药物的抗抑郁作用，然而在本研究中评价F13A抗抑郁作用的行为学太过单一，且缺乏相应的生化指标。在将来的研究中还需应用慢性不可预测应激、慢性社会挫败等更接近抑郁症病人的动物模型进行评价F13A的抗抑郁样作用以及检测相关蛋白的表达。