维生素E对暴露于高温及PM2.5中COPD大鼠呼吸系统的保护性作用*

刘江涛， 罗 斌， 贺小桃， 李兰玉， 徐生刚

(1. 兰州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学研究所， 甘肃 兰州 730000； 2. 河西学院医学院， 甘肃 张掖 734000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以不完全可逆的气流受限并呈进行性发展为特征的肺部疾病[1]。据世界卫生组织报道，在2015年时，COPD已经成为全球第四大死因疾病，并有可能持续恶化[2]。PM2.5是指空气动力学直径小于等于2.5 μm的颗粒物，可通过呼吸道进入人体肺部，更小的颗粒可进入血液引起全身多个靶器官的损害。体内与体外实验研究均表明，PM2.5进入肺部，可引起肺泡巨噬细胞、肺上皮细胞等分泌大量炎症因子[3-5]，例如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)等，引起全身炎症反应。COPD本身是一种以慢性炎症为特征的疾病，更易受到PM2.5的影响，导致肺部炎症反应的加重，进而导致COPD疾病的进展[6]。气温的变化(例如高温热浪、寒潮)会影响人体的健康，尤其是对于呼吸系统疾病患者。目前，高温热浪是指日最高气温达到或超过35℃并持续达3 d以上，我们的前期研究发现高温热浪会降低大鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能[7]。维生素E是一种常见的脂溶性维生素，可有效对抗自由基，是一种重要的抗氧化剂，在体内有一定的对抗氧化应激及炎症的作用[8, 9]。本研究拟通过香烟与脂多糖制造COPD大鼠模型，利用PM2.5与高温对COPD大鼠进行联合暴露，并适当给予维生素干预，观察大鼠体内各项炎性指标的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

脂多糖(Sigma，美国)；香烟(兰州牌，兰州)；维生素E(双鲸药业，青岛)；诱导性一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒(南京建成，南京)；肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒(Elabscience，武汉)；单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)ELISA试剂盒(Elabscience，武汉)。大气颗粒物采样器(Airmetrics，美国)；人工气象环境模拟箱(三元TEMI1800，韩国)；大鼠肺功能检测系统(EMKA GYD-003，法国)；真空冷冻干燥机(Christ ALPHA2-4LD,德国)；光学显微镜(Olympus DP-72，日本)。

1.2 PM2.5样品采集

于兰州大学某实验楼顶(四层)空旷地带设置采样点，利用PM2.5采样器于2016年1月至12月进行连续采样，流量为10 L/min，样品采集于玻璃纤维滤膜。处理时将收集到样品的滤膜剪为1 cm ×1 cm的小方块，利用去离子水将其完全浸没，超声波清洗仪振荡洗脱颗粒物，震荡三次，每次30 min。6层纱布过滤，收集滤液于培养皿内，真空冷冻干燥，颗粒物称重后4℃避光保存，待用[10]。

1.3 实验动物

于中国农业科学院兽医研究所购买54只6周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠【生产许可证号：SCXK(甘)2015-001】，控制动物房内环境温度为(20±2)℃，湿度为40%～60%，昼夜节律(12 h∶12 h)，适应性饲养一周，自由进水及食物。

1.4 COPD大鼠模型的建立

将所有大鼠按体重进行随机分组，分为9组，其中6组采用熏烟联合脂多糖法制造COPD大鼠模型，另外3组大鼠于常规饲养环境中饲养。造模时，将6只大鼠同时置于自制熏烟箱内，并点燃6只香烟(每支香烟含焦油8 mg，烟碱0.9 mg，CO 12 mg)，持续1 h，熏烟期间随时监测大鼠状态并进行记录。每周进行6 d熏烟，并在第7日行脂多糖气管滴注，整个造模过程持续9周[11]。

1.5 实验动物分组及干预

9组实验组分别为常温健康组(3组，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+维生素E)，常温COPD组(3组，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+维生素E)及高温COPD组(3组，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+维生素E)。将PM2.5配置成3.2 mg/ml的悬液进行气管滴注(0.25 ml/只)，非PM2.5暴露组给予同等体积的生理盐水滴注；维生素E配制成浓度为20 mg/ml的溶液，按40 mg/kg的剂量进行腹腔注射干预，待PM2.5及维生素E干预完毕后，行8 h/d高温(40℃)暴露，并选择20℃作为常温对照，持续3 d。模拟高温、PM2.5染毒及维生素E末次处理后进行大鼠肺功能检测，分别测定大鼠平静状态下的最大吸气流量(peak inspiratory flow, PIF)和最大呼气流量(peak expiratory flow, PEF)。

1.6 生物标本采集和检测

末次染毒24 h后进行大鼠麻醉，处死大鼠，取新鲜右肺上叶，迅速转移至4%多聚甲醛固定。摘取新鲜右肺中叶，使用0.9%生理盐水制作10%肺组织匀浆，3 000 r/min离心15 min后收集上清，转移至-80℃冰箱储存，待检。

1.6.1 肺组织病理 利用4%多聚甲醛固定右肺上叶组织24 h后，制作HE染色的肺组织病理切片，在光学显微镜下观察病理变化。

1.6.2 炎性及氧化指标检测 肺组织MCP-1和TNF-α检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，iNOS采用比色法进行检测，所有检测过程严格按照产品说明书进行操作。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠体重及行为学变化

造模期间，记录健康组大鼠及模型组大鼠的体重变化，结果如图1所示。在造模前，各组大鼠体重相仿，无统计学差异，精神及日常行为正常。随着造模过程的推进，模型组大鼠行为活动减少，摄食量降低，精神状态不佳，伴随明显喘息等呼吸系统症状，造模结束后，模型大鼠体重低于健康大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。

Fig.1Body weight changes of rats during COPD modelling

2.2 大鼠的肺功能检测

肺功能检测结果如表1所示，与常温健康生理盐水组相比，常温及高温COPD各组的PIE和PEF均显著降低(P<0.05)，提示由于实验因素致使大鼠肺功能减退；而维生素E干预对肺功能的改善并无明显效应。

Tab.1Results of lung function of rats in different intervention groups (n=6)

GroupPIF (ml/s)PEF (ml/s)NH PM2.5 0 mg/ml48.33±3.2529.13±2.89 PM2.5 3.2 mg/ml36.43±1.28∗24.48±2.51∗ PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E26.35±2.30∗17.86±2.52∗NC PM2.5 0 mg/ml37.50±2.25∗26.12±2.57∗ PM2.5 3.2 mg/ml32.06±1.06∗21.83±1.55∗# PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E35.03±1.17∗22.21±1.37∗HC PM2.5 0 mg/ml8.54±1.20∗6.43±1.73∗ PM2.5 3.2 mg/ml6.93±0.91∗5.80±1.49∗ PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E8.34±1.04∗6.74±1.59∗

NH: Normal temperature health group; NC: Normal temperature COPD group; HC: High temperature COPD group

*P<0.05vsNH + saline group;#P<0.05vsNC + saline group

2.3 大鼠肺组织病理学检测

图2所示为各组大鼠肺组织病理改变。可见常温健康生理盐水组肺组织结构基本正常，而PM2.5暴露组中，可见肺泡中颗粒物沉积聚集，炎性浸润明显，尤其是在COPD组中，肺泡数量减少、肺泡融合，肺大泡形成，提示COPD组大鼠肺组织损伤更严重。高温刺激下，各组大鼠的肺组织中出现严重的炎性细胞浸润及大量尘细胞，肺泡结构紊乱，支气管上皮增生。

2.4 肺组织TNF-α、MCP-1及iNOS水平的检测

表2所示为各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、MCP-1及iNOS水平变化。在常温健康组与高温COPD组中，维生素E干预均显著降低了TNF-α在肺组织匀浆中的水平(P<0.05)；与常温健康生理盐水组相比，各PM2.5干预组中MCP-1水平均有显著提高(P<0.05)，使用维生素E干预后，相比于对应的PM2.5干预组，MCP-1水平显著降低，提示了维生素E的效果；高温组各组中iNOS活性均显著增高(P<0.05)，维生素E可显著降低由于高温与PM2.5暴露引起的COPD大鼠肺组织匀浆中iNOS活性的升高(P<0.05)。

Tab.2Levels of TNF-α, MCP-1 and iNOS in lung tissues of different groups (n=6)

GroupTNF-α (pg/ml)MCP-1 (pg/ml)iNOS (U/mgprot)NH PM2.5 0 mg/ml1607.67±177.5619.15±3.340.20±0.03 PM2.5 3.2 mg/ml1875.88±537.9324.65±2.15∗0.24±0.05 PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1309.95±134.04△17.19±1.58△0.16±0.04NC PM2.5 0 mg/ml1456.87±360.8224.56±3.72∗0.32±0.04∗ PM2.5 3.2 mg/ml1658.36±298.6626.47±1.70∗0.31±0.04 PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1257.86±153.5618.47±2.71#●0.24±0.02HC PM2.5 0 mg/ml1670.36±242.5323.39±2.30∗0.45±0.11∗ PM2.5 3.2 mg/ml1707.03±174.3025.23±3.02∗0.54±0.15∗ PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1295.42±126.24○18.81±2.41▲○0.37±0.03∗○

NH: Normal temperature health group; NC: Normal temperature COPD group; HC: High temperature COPD group

*P<0.05vsNH+saline group;#P<0.05vsNC+saline group;▲P<0.05vsHC+saline group;△P<0.05vsNH+PM2.53.2 mg/ml group;●P<0.05vsNC+PM2.53.2 mg/ml group;○P<0.05vsHC+PM2.53.2 mg/ml group

3 讨论

流行病学研究表明，高温及大气污染物对人群健康会产生协同影响。Chen等人在欧洲八个城市的研究表明每日自然总死亡率和心血管死亡率与空气污染之间的关系受到气温的影响[12]；Tian等人的一项研究表明在高温条件下，PM10对女性及老年人的效应更强[13]；一项来自台湾的研究表明在气温较高时，PM2.5对老年人COPD相关急诊入院率 (65-79岁)影响最大[14]。本课题组前期体外实验发现高温可能抑制肺泡巨噬细胞的活性，触发氧化应激和炎症反应而加剧PM2.5的毒性作用[7]。本研究选择高温热浪及PM2.5联合暴露，结果表明二者联合暴露可导致COPD大鼠肺功能明显降低，各指标检测结果提示PM2.5与高温热浪暴露激活了大鼠体内氧化应激及炎症反应，维生素E干预后有一定的改善。

MCP-1是由MCP-1基因编码的一种蛋白质，单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等可在某些刺激因素作用下分泌MCP-1[15]。本研究中，健康及COPD大鼠在PM2.5与高温暴露下，MCP-1水平显著上升，提示MCP-1可能参与肺组织病理改变过程。病理切片显示各组大鼠均有不同程度的肺泡融合及炎性渗出，肺泡结构紊乱，支气管上皮增生明显，其可能机制为MCP-1作为一种炎性因子，对单核/巨噬细胞具有特异性趋化激活作用，可诱导单核/巨噬细胞进入炎性部位，产生一系列反应，加重肺组织内炎症反应及氧化应激。而当肺组织损伤后，巨噬细胞可聚集到损伤组织周围并被激活，释放大量TNF-α，进一步诱导巨噬细胞聚集，分泌大量MCP-1，扩大炎症反应[16]。

iNOS在生理状态下不表达，但受感染、炎症等病理刺激后可高表达于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞中[17]，高温组各组iNOS活性均显著增高。而iNOS可催化合成大量NO，NO有氧自由基活性，可通过多种途径损害细胞，参与DNA损伤，导致细胞炎症。

维生素E是一种重要的抗氧化剂，其与体内其他抗氧化剂的联合作用可有效保护机体。陈业文等人的研究表明维生素E对较高剂量PM2.5暴露后的小鼠巨噬细胞起着一定的保护作用[18]；同样，杜喜浩等人的研究也表明补充维生素E可以通过提高抗氧化物酶SOD及GSH-Px的活性进而改善心肺系统炎症反应和氧化应激损伤[19]。在本研究中，在常温健康组与高温COPD组中，高温维生素E干预组中iNOS活性降低，表明维生素E可以减少NO等具有氧自由基活性物质生成；田程远等人的研究表明PM2.5染毒可引起大鼠肺部的炎性损伤，可能与肺部氧化应激和内质网应激通路的激活相关[20]，即氧化应激能启动并加剧炎症反应，可推测过多的ROS可以上调与炎症有关的基因产物如MCP-1等的表达，而由于维生素E对于氧自由基活性的抑制，降低了TNF-α及MCP-1在肺组织中的表达，从而降低氧化应激和炎症水平。

综上所述，高温与PM2.5可引起并进一步加重COPD大鼠的炎症反应，而维生素E干预可改善高温和PM2.5对COPD大鼠呼吸系统的影响。