红景天苷对力竭大鼠心肌细胞凋亡通路的影响*

郄 涛， 徐 鹏， 张丙信， 曹雪滨△

(1. 保定市第一中心医院急诊科， 河北 保定 071000； 2. 陆军第82集团军医院心内科， 河北 保定 071000；3. 保定市第一中心医院病理科， 河北 保定 071000)

运动是机体的一种外在刺激, 运动强度不同会对心脏产生不同影响。适宜运动对心脏有益，高强度运动如力竭性运动，超出人或动物生理极限，则导致心脏损伤。在当今军队高强度实战化训练和体育竞技中，如何进行科学的运动训练，减少运动和训练所致的心肌损伤，提高成绩是军事训练和体育运动中需关注的课题。

力竭运动是疲劳运动的一种特殊形式，是在疲劳时继续运动，直到肌肉和器官不能维持运动的状态[1]。力竭运动造成心肌损伤，课题组前期实验也证实力竭运动可造成心脏超微结构破坏，心功能减低及心电改变，能量代谢障碍、线粒体功能异常[2-4]。力竭运动时体内代谢率增加，心肌需氧量增加，导致心肌缺血缺氧。赵敬国发现大鼠心电图在力竭运动后出现心肌缺血导致ST-T变化。心肌缺血缺氧是力竭运动所致心脏损伤的始动因素。力竭运动能上调心肌丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中p38磷酸化水平，其与细胞凋亡密切相关的[5]。Carraro等的研究显示，力竭运动及过度训练可致心肌细胞凋亡数量显著增加。因此凋亡亦是造成力竭运动心脏损伤的原因之一。目前认为细胞凋亡主要通过细胞外死亡受体和细胞内线粒体介导的两条途径实现。因此，本试验观察本方案力竭运动凋亡情况及对上述凋亡途径的影响。

红景天苷(salidroside, Sal)由植物红景天中高效萃取所得，其具有力竭心脏保护作用，可有效减少力竭所致的心肌结构损伤，改善心肌缺血，并改善心肌线粒体能量代谢[2]。红景天苷可抑制缺血/再灌注损伤、急性心肌缺血缺氧等多种因素诱导的细胞凋亡[6, 7]。因此，本实验观察红景天苷能否通过减少心肌缺血，调控心肌细胞死亡受体和线粒体介导的凋亡途径相关蛋白来改善力竭运动所致心肌细胞凋亡，发挥对力竭心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

MutiscanGO 酶标仪，SIGMA 3K15高速冷冻离心机。99%红景天苷粉剂(Lot：080901-1)，缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin, IMA)检测酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉华美公司)，心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)试剂盒(南京建成公司)、脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)试剂盒(武汉华美公司)，原位细胞凋亡检测试剂盒(Roch公司)。Caspase-8 、Bax、Bcl-2抗体(英国Abcam公司)，Caspase-3、Caspase-9、Fas/FasL、细胞色素C(Cytochrome C，Cyto-C)抗体(美国SantaCruz公司)，β-actin抗体(Sigma公司)，二抗(中杉金桥公司)，HRP显色试剂盒(Piece公司)。

1.2 动物分组及模型制备

雄性SD大鼠24只，体重(325±28)g，购自军事医学科学院实验动物中心，适应性饲养期间进行3次无负重适应性游泳，每次 25 min。按照随机数字表法分为4组(n=6)：对照组(Con)、力竭组(EE)、低剂量红景天苷预处理力竭组(SLE)、高剂量红景天苷预处理力竭组(SHE)。适应性饲养结束后，SLE、SHE组分别给予红景天苷(15，30 mg/(kg·d))，Con组、EE组给予0.9%NaCl(3 ml/(kg·d))腹腔注射15 d。于给药结束后次日正式实验，正式实验前动物禁食12 h。实验时Con组不进行游泳训练。于腹腔给药结束后次日EE组、SLE组、SHE组大鼠分别负体重质量3%锡丝，按Thomas力竭标准，一次性游泳运动至力竭。大鼠游泳槽为清洁塑料圆桶，高60 cm，直径55 cm，水深50 cm。水温控制在32℃，上下浮动不超过1℃。力竭运动结束后即刻麻醉取材。

1.3 血清及心肌标本采集及制备

对照组及力竭组大鼠戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，开胸下腔静脉取血，3 000 r/min, 离心20 min，-80℃保存备用。

取血后快速将心脏取出，用冷生理盐水洗净。于心尖部心室前壁肌切取小块心肌组织，4%多聚甲醛中固定24 h后，用梯度浓度酒精行常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后进行切片，6～8张，厚度为4 μm，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，56℃烘烤40 min备用。其余心肌-80℃保存备用。

1.4 苏木精-碱性复红-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid，HBFP)染色法观测心肌缺血缺氧面积

将心肌组织制成切片，切片脱蜡至水，苏木素染液浸染5 min，流水冲洗5 min；1%盐酸分化2～3 s，流水冲洗10 min；0.1%碱性红液3 min，蒸馏水洗5～10 s；纯丙酮5～10 min；0.1%苦味酸纯丙酮浸染5～15 min；二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察并摄片。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行图像处理。测定每个视野的心肌缺血缺氧面积。

1.5 酶联免疫吸附法检测IMA、cTnI、BNP血清含量

按照试剂盒操作步骤测定每组大鼠血清中IMA、cTnI、BNP含量，用酶标仪检测各孔450 nm处的OD值及标准品的OD值。根据标准曲线及样本OD值计算各样本浓度。

1.6 大鼠心肌细胞凋亡的原位标记(TUNEL)检测与半定量分析

细胞凋亡的原位标记检测是每一标本取3个不同部位的切片各1张。脱蜡，再梯度水合后采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)缺口末端标记法(TUNEL)检测。具体步骤按试剂盒说明书进行。每张切片随机拍摄5个视野进行阳性细胞计数，以凋亡阳性细胞数所占百分比的平均值作为凋亡指数(apoptotic index, AI)。

1.7 免疫组化检测大鼠心肌Bax、Bcl-2含量

采用SP法, 按照试剂盒说明书, 阴性对照用PBS 代替一抗。若胞浆呈棕黄色背景，棕黄色颗粒沉积于细胞胞浆即阳性反应；若细胞核及膜为蓝色，其它部分显示淡蓝色即为阴性反应。利用低倍、高倍光镜着重观察心肌组织的阳性反应情况。结果用灰度值表示。

1.8 Western-blot法检测大鼠心肌Fas、Cyto-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9含量

各组在适量细胞裂解液(已做冰预冷处理)中分别加入200 mg大鼠左心室前壁心肌组织，冰上裂解40 min。 4℃，12 000 r·min-1，离心20 min，之后收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样本进行SDS-PAGE电泳，100 V 2 h转PVDF膜，5%BSA封闭1 h，一抗稀释浓度Fas 1∶500、Cyto-C 1∶ 1 000、Caspase-3 1∶1 000、Caspase-8 1∶500、Caspase-9 1∶500，4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，每次10 min，后加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL检测试剂盒显影、洗片。 用Bandleader 5.0软件对扫描后图像进行灰度值分析。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 红景天苷对力竭运动大鼠心肌组织缺血缺氧面积的影响

HBFP染色结果显示，Con组大鼠心室结构大致正常，心肌纤维结构相对清晰，染色均匀，各个细胞排列整齐规整，卵圆形细胞核呈蓝黑色，位于细胞中央，未见明显偏离；EE组中心肌纤维呈现多种形态，染色相对不均匀，细胞排列不整齐，胞浆内有大量的片状红色缺血缺氧改变；SLE组与SHE组心肌结构较EE组细胞排列更加规整，心肌纤维结构更加清晰。胞浆内有少量的片状红色缺血缺氧改变，缺血缺氧程度减轻。计算机图像分析结果显示：与Con相比，力竭组心肌缺血缺氧面积明显增加(P< 0.01)。SLE组与SHE组心肌缺血、缺氧面积明显少于EE组；且SHE组较SLE组缺血缺氧面积小(图1)。

Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low dose sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High dose sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.2 红景天苷对力竭运动大鼠血清 IMA、cTnI、BNP含量的影响

与Con组相比，大鼠血清IMA含量EE组SLE和SHE组显著升高(P<0.01)。SLE组和SHE组较EE组降低(P<0.01)，且SHE组较SLE组降低更为明显(P<0.01)。血清cTnI、BNP水平与Con组比较，EE组、SLE组、SHE组均显著升高(P<0.01)。SHE组明显低于EE组(P<0.01，表1)。

IMA(U·ml-1)BNP(ng·L-1)c-TnI (pg·ml-1) Con15.31±1.98197.12±29.42126.81±13.48EE41.24±4.84∗∗285.58±32.89∗∗175.61±21.64∗∗SLE32.09±2.06∗∗##255.46±11.41∗∗163.44±13.29∗∗SHE18.85±2.17∗∗##△△233.08±27.64∗∗##154.20±20.42∗∗##

IMA: Ischemia modified albumin; BNP: Brain natriuretic peptide; cTnI: Cardiac troponin I ; Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low does Sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High does Sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.01vsSLE group

2.3 红景天苷对力竭运动大鼠心肌组织AI的影响

凋亡细胞即阳性细胞呈现棕黄色的细胞核。Con组偶见阳染颗粒，EE组出现较多散在的阳染颗粒，Sal干预组阳染颗粒有所减少。AI结果显示：EE组和SLE组较Con组显著升高(P<0.01)。SLE组和EE组两组之间无显著统计学差异(P>0.05)，SHE组AI降低明显，与SLE组和EE组比较有显著统计学意义(P<0.01, 图2)。

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.05vsSLE group

2.4 红景天苷对力竭运动大鼠心肌组织Bax，Bcl-2表达的影响

阳性信号定位于细胞浆和细胞膜，呈棕黄色细颗粒。对照组胞浆内可见少量的Bax阳性表达，呈细颗粒状，染色浅 。EE组心脏Bax阳性表达增强，胞浆内可见大量的点状或小块状棕褐色颗粒；Sal干预组阳性表达减少，SLE组内可见较多的阳性表达颗粒，SHE组可见少量的棕褐色颗粒。计算机图像分析结果显示：Bax蛋白表达量EE组、SLE组和SHE组较Con组显著升高(P<0.01)，SHE组和SLE组较EE组明显降低，有统计学差异。Bcl-2蛋白表达量EE组、SLE组较Con组显著降低(P<0.01)，SHE组较EE、SLE组明显升高(图3)。

**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.5 红景天苷对力竭运动大鼠心肌Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的影响

EE组及SLE组Fas，Cyto-C，Caspase-3， Caspase-8，Caspase-9较Con组显著升高(P<0.01)，SHE组Fas，Caspase-3，Caspase-8较Con组显著升高。SLE组Fas，Cyto-C，Caspase-9和SHE组全部参数较EE组降低，均具有明显统计学意义(P< 0.01)，SHE组Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8较SLE组明显降低，并具有统计学差异(图4)。

3 讨论

本实验证实Sal对力竭所致的心脏损伤具有保护作用。Sal可改善力竭运动造成的心肌缺血。Sal能降低Bax，增加Bcl-2的表达，降低Bax/Bcl-2比值，抑制死亡受体和线粒体凋亡通路中相关蛋白Fas、Cyto-C、Caspase-3，Caspase-8, Caspase-9的表达从而降低力竭心脏凋亡水平，发挥心脏保护作用。

*P<0.05,**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05,△△P<0.01vsSLE group

力竭运动时心脏需氧量急剧增加，心肌血流相对供应不足。此外，NO与内皮素的失衡，冠脉血流量降低，均可诱发心肌缺血。本实验HBFP染色表明力竭运动造成心肌缺血，与孙晓娟应用跑台进行力竭运动所得结果相同[8]。IMA是心肌缺血发生后到细胞坏死前的早期敏感特异指标。其阳性结果表明心肌缺血。Lee在研究运动负荷试验(EST)中发现IMA水平可预测EST后心肌缺血的严重程度[9]。红景天苷可呈剂量依赖性减少力竭大鼠心肌缺血面积，降低IMA水平，提示红景天苷可改善力竭运动导致的心肌缺血,但其机制需在今后研究中继续探索。

心肌对缺血缺氧极其敏感，在缺血、缺氧的情况下，各种损害因子增多，脂质过氧化水平增加，细胞膜稳定性及完整性破坏，导致心肌细胞凋亡。心肌凋亡的程度与运动强度有一定的关系，适度的游泳训练降低心肌凋亡水平[10]。但持续大强度运动和力竭运动则通过细胞坏死和细胞凋亡两种途径使心肌出现损伤。本实验亦显示力竭运动后大鼠心肌细胞凋亡显著增加。心肌细胞凋亡水平上调的直接后果就是心肌数量减少，导致心脏损伤。

Bcl-2家族中的抗凋亡成员Bcl-2和促凋亡成员Bax是细胞凋亡调控的重要基因，主要在凋亡执行阶段发挥作用。Bax/Bcl-2比值低，细胞存活率高。本实验中力竭运动导致大鼠心肌细胞中Bax增加，Bcl-2减少，Bax/Bcl-2比值升高，导致细胞凋亡增加。类似报道还有力竭运动和过度训练可导致大鼠心肌细胞Bcl-2 mRNA表达下降，Bax mRNA水平升高，且二者比值明显减小，心肌细胞凋亡显著增加。

Fas是死亡受体介导凋亡途径的启动因子。Fas与FasL结合后可诱导产生凋亡信号，启动caspase级联反应，激活Caspase-8，进一步活化效应型Caspase-3，引起细胞凋亡事件发生。Caspase-3的表达增强可以增加组织细胞的凋亡。Caspase-8是死亡受体通路的关键起始因子，活化的Caspase-8还能把死亡受体通路和线粒体通路联系起来。Cyto-C是线粒体介导的凋亡通路的启动因子之一。本实验力竭运动造成心肌组织Fas、Cyto-C含量显著增加。与金其贯、张钧等人研究结果相同。力竭运动导致大鼠心肌细胞凋亡通路中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等相关凋亡蛋白显著增加。与本实验类似的研究也显示，过度训练的大鼠肾组织Caspase-8的表达于力竭后即刻、6 h及24 h逐渐增强，均显著高于对照组[11]。对青年男性专业运动员和大学生的研究发现，力竭运动后即刻Caspase-3和Caspase-9的活性均显著升高。孙晓娟发现力竭运动可使大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达显著升高，应用抗氧化剂能够抑制心肌细胞Caspase-3活性，减少心肌细胞凋亡数量[8]。红景天苷剂量依赖性抑制力竭心脏死亡受体和线粒体凋亡通路中的Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表达，减少心肌细胞凋亡，保留尽可能多的心肌细胞，从而起到力竭心脏保护作用。