红景天对2型糖尿病大鼠认知功能障碍的保护作用探讨

王淑兰，卢娟娟，张惠琴

（甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

糖尿病的慢性并发症之一是认知功能障碍，糖尿病认知功能障碍极大地危害了人们的身体健康并严重影响着人们的生活质量[1]。2型糖尿病（T2DM）为目前对人类健康最具威胁的疾病之一，葡萄糖是大脑最主要的能量来源，正常情况下，线粒体利用葡萄糖为大脑提供能量，但在高血糖的情况下，线粒体利用葡萄糖产生大量的活性氧自由基，使机体发生氧化应激增加，脑细胞功能受损严重，出现认知能力下降[2-4]。2型糖尿病的另一基本特征是胰岛素抵抗，无论是胰岛素抵抗还是胰岛素分泌不足都可以影响脑内葡萄糖代谢、脑细胞渗透压的改变和神经营养不足，从而改变神经生理功能，导致认知功能障碍[5]。中枢神经系统产生胰岛素抵抗，胰岛素信号通路发生改变，出现了阿尔茨海默病（AD）特征性的病理变化，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和老年斑的形成。Aβ对神经系统的毒性作用是使血管壁淀粉样变直接导致血管硬化，弹性变差，甚至容易破裂或形成血栓，还诱使神经细胞凋亡，引发认知障碍，因此，防治AD发病的重要策略之一是抗氧化、抗凋亡。2型糖尿病由于糖利用障碍，引起体内大量自由基的形成，导致机体氧化应激反应明显，引起血流动力学改变和微血管病变，并使血管动脉硬化明显，造成血管狭窄，最终引起缺血、缺氧及神经损害，导致认知功能障碍的形成。

研究表明，胰岛素不仅具有调节脑内新陈代谢、促进神经元的生长发育、调控脑内神经递质释放的作用，而且在认知等高级智能活动中起到了重要的作用。胰岛素在大脑内的作用已成为海内外研究的热点，关注胰岛素抵抗与AD的关系可能为AD的早期防治提供有效的新途径。

探讨胰岛素抵抗动物模型脑组织损伤及红景天保护作用的相关机制，揭示AD等神经退行性疾病的发病机制并选择有效的防治靴点提供理论依据，同时探究天然药物多效性的特点，从天然药物宝库中发掘有效预防和治疗记忆减退的药物提供应用价值。以往研究证明，红景天具有抗缺氧、抗炎和调节神经内分泌的作用[4-8]。红景天的主要单体成分是红景天苷，红景天苷能否改善AD所致认知和记忆障碍以及其通过哪些机制发挥作用的研究报道很少。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性成年SD大鼠，体重250~350 g，从兰州大学实验动物中心购买，该实验所有的操作及相关流程遵守兰州大学医学院动物实验委员会的相关指导准则。第一周进行喂养以适应环境，采用啮齿类动物饲料的喂食标准，昼夜周期为（8：00—20：00），自由进食饮水，室温（22±2）℃。

1.2 药物及主要试剂

链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）；红景天干燥粉末（甘肃省中医研究所）；血糖仪（三诺生物传感技术有限公司）；血糖仪试纸条（三诺生物传感技术有限公司）；大鼠解剖手术台（北京合力科创科技发展有限公司）；胰岛素试剂盒ELISA（上海博耀生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；活性氧（ROS）检测试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；Aβ酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海抚生实业有限公司）；1%戊巴比妥钠（湖北鸿运隆生物科技有限公司）。

1.3 仪器

水迷宫视频分析系统（中国医学科学院药物研究所）；低温离心机（湖南湘仪实验室开发有限公司）。

1.4 给药方法及分组

24只8周健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，选取8只作为正常对照组（随机），啮齿类动物饲料喂食，其余用高脂高糖高蛋白饲料喂养8周作为T2DM模型组，腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）27 mg/kg制备T2DM模型，30 min内注射完毕，正常对照组注射生理盐水。腹腔注射STZ 3天后，眼底静脉丛取血和制备血清，测定大鼠空腹血糖（FPG），血清胰岛素含量用胰岛素ELISA检测试剂盒测定，采血前禁食14 h，其FPG≥11.1 mmol/L，判断T2DM模型成功与否，造模成功后，各组大鼠按上述方法继续饲养4周，根据文献Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能[9]，将存在认知功能障碍的T2DM大鼠随机分为两组：AD组、红景天干预组，两组大鼠高糖高脂喂养，同时分别用等体积生理盐水和红景天苷（50 mg/kg/d）灌胃处理21天。正常对照组等量生理盐水灌胃。各组大鼠每天上午10点对其进行灌胃，1次/d。

1.5 大鼠的认知功能用Morris水迷宫视频分析系统检测

实验干预措施结束24 h内开始Morris水迷宫检测[10]。水池直径为160 cm，高50 cm，平台直径10 cm，高度30 cm。池壁上有N、E、S、W 4个等距离点，将水池分为4个象限，平台可放在任意一个象限内，平台置于水面下1 cm，水温（25.0±1.0）℃，水中加入漂白剂，使水呈乳白色，在实验期间迷宫外参照物不变。试验前5天为训练时间，第6天为测试。每天上、下午各训练4次（间隔6 h），相邻两次训练时间间隔为1 min。训练时，入水点随机选取，将各组大鼠面向池壁放入池中，记录各组大鼠寻找到平台并爬上平台所用时间，即逃避潜伏期，如果大鼠在2 min内未能寻找到平台，须将其人为引至平台，此时潜伏期记为2 min。于第5天训练结束后撤除水下平台，于第6天将大鼠面向池壁于同一入水点放入池中，记录逃避潜伏期和其在2 min内跨越平台的次数。

1.6 检测大鼠海马组织中活性氧自由基（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）含量

各组大鼠于水迷宫实验结束后，用1%戊巴比妥钠（0.4 mL/kg）进行腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉取血，分离血清后置于-20℃冰箱中备检。每组大鼠取血后，立即断头取脑，分离海马进行匀浆，取上清液，一部分置-20℃冰箱中备检，一部分大脑海马组织用于测定细胞内ROS和SOD含量。超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒和活性氧自由基（ROS）检测试剂盒测定各组大鼠海马组织内SOD和ROS含量，具体实验方法见产品说明书。

1.7 血清和脑组织β淀粉样蛋白（Aβ）含量检测

按ELISA试剂盒操作说明测定血清和海马组织中Aβ含量。

1.8 统计方法

实验数据均采用SPSS20.0统计学软件分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对AD大鼠认知功能的影响

AD组逃避潜伏期明显长于正常对照组（P＜0.05），跨越平台的次数明显少于正常对照组（P＜0.05）；红景天干预组逃避潜伏期明显短于AD组（P＜0.05），跨越平台的次数明显多于AD组（P＜0.05），红景天苷能够改善大鼠认知能力，见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期和跨越次数（±s）

表1 各组大鼠逃避潜伏期和跨越次数（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与 AD 组比较，#P＜0.05

跨越次数（次）5.46±0.311.76±0.14*3.17±0.37#组别正常对照组AD组红景天干预组逃避潜伏期（s）14.25±1.5640.96±3.26*25.04±32.58#

2.2 红景天苷对AD大鼠海马组织内ROS生成和SOD活性影响

大鼠海马组织内ROS和SOD含量见表2。AD组大鼠海马组织内SOD含量明显低于正常对照组（P＜0.05），ROS含量明显高于正常对照组（P＜0.05）；红景天干预组大鼠海马组织细胞内SOD含量明显高于AD组（P＜0.05），ROS含量明显低于AD组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠海马SOD和ROS表达比较（±s）

表2 各组大鼠海马SOD和ROS表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与 AD 组比较，#P＜0.05

ROS 210.14±9.67320.41±11.93*230.83±11.23#组别正常对照组AD组红景天干预组SOD（U/mg）145.27±5.33103.18±4.28*121.33±2.18#

2.3 大鼠血清和海马组织中Aβ含量比较

与正常对照组比较，AD组大鼠血清和海马组织中Aβ含量显著升高（P＜0.05），红景天干预组与AD组比较，血清和海马组织中Aβ 含量显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 大鼠血清和海马组织中Aβ含量（±s，μg/L）

表3 大鼠血清和海马组织中Aβ含量（±s，μg/L）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与AD组比较，#P＜0.05

海马Aβ 0.217±0.0240.672±0.057*0.324±0.064#组别正常对照组AD组红景天干预组血清Aβ 2.632±0.5245.864±0.736*4.347±0.582#

3 讨论

3.1 红景天苷对T2DM所致AD大鼠模型认知功能障碍改善作用的实验原理

AD认知功能受损早期主要表现是记忆减退和学习能力的降低，红景天苷对T2DM所致AD大鼠模型认知功能障碍的改善作用采用Morris水迷宫实验来评估[9-11]，用本研究方法来评估T2DM所致AD大鼠学习能力和记忆力是一种经典的工具。用逃避潜伏期来表示大鼠放入水中到找到隐匿平台并爬上平台所需时间。逃避潜伏期愈短，学习能力愈强，反映大鼠对空间认知能力的越高，具有认知功能障碍的大鼠则表现出逃避潜伏期越长。此实验中，由于前期的强化训练，大鼠对逃生平台的具体位置有准确的记忆，撤去平台后，大鼠将反复通过原隐匿平台所在区域并试图找到平台，这种行为反映了大鼠对平台位置的准确记忆能力和对前期经验的记忆能力，此称为记忆保持能力。

在此实验的测评中，给予高糖高脂高蛋白喂养的AD组大鼠游泳轨迹繁乱、盲目，逃避潜伏期较正常对照组明显延长。撤去水下隐匿平台后，AD组大鼠在原隐匿平台所在象限停留时间较正常对照组明显延长，跨平台次数明显减少，表明大鼠空间定向、定位能力及记忆能力出现了显著损伤，也表明T2DM模型组大鼠出现了认知功能障碍。在水迷宫实验测评中，红景天苷干预治疗的AD模型大鼠在学习记忆能力方面，表现强于AD组大鼠。在各时间点红景天干预组逃避潜伏期较AD组明显缩短，在测试时间内跨平台次数明显增加。提示红景天苷干预治疗可较好地改善T2DM所致AD组的学习记忆功能。以上数据表明，红景天苷对AD实验大鼠模型的认知功能障碍具有很好的改善作用。

3.2 红景天苷对糖尿病模型大鼠学习记忆能力及氧化应激的影响分析

超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）是氧化应激的标志物[12-13]。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，体内产生过多活性氧自由基（ROS），氧化程度超出氧化物的清除，从而导致组织损伤[14]。大量生成的ROS不仅直接攻击细胞生物膜、诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，而且ROS还可以作为第二信使，激活核转移，进而增加半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员的酶活性，导致神经细胞的损伤和凋亡。ROS水平可直接反映细胞内氧化应激的水平。在生理情况下，体内氧自由基生成与清除保持一定的平衡。SOD是一种源于生命体的活性物质，是机体抗氧化平衡的重要指标[15]，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的超氧阴离子自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。因此，生物抗氧化抗凋亡机制中，SOD的地位愈来愈重要，对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

此实验表明，大鼠海马组织细胞内ROS生成明显降低，由此提示红景天苷在一定程度上能够增加SOD活性而减轻氧化应激对神经元细胞所造成的损伤。

引起学习能力和记忆功能衰退又一重要病理因素是海马组织细胞凋亡及功能受损。红景天是一种高效的抗氧化的中药。红景天能够修复氧化应激所造成的细胞损伤，从而提高大脑学习及记忆能力、改善脑细胞功能，从而改善和治疗AD。

3.3 红景天苷可以降低AD模型大鼠海马组织中Aβ含量降低

高胰岛素血症时，胰岛素与Aβ竞争性结合胰岛素降解酶，使胰岛素降解酶活性下降，导致Aβ降解减少，聚集的Aβ可以通过血—脑屏障进入中枢神经系统；反过来，Aβ的沉积又可阻碍胰岛素信号的传递[12]。胰岛素可调节Aβ的水平，胰岛素抵抗可通过增加Aβ蛋白表达而导致认知功能障碍。同时，Aβ不能正常降解，逐渐沉积形成老年斑，诱导神经退行性变甚至凋亡，导致认知功能障碍[15-16]。

细胞内神经纤维缠结和细胞外β淀粉样蛋白沉积和大量的神经元丧失是AD的主要病理特征。AD发病的中心环节是Aβ在脑组织细胞内的异常代谢和沉积。Aβ介导并参与多种神经毒副作用，尤其是氧化应激损伤、神经元凋亡危害最大。本实验证实，在一定程度上红景天苷能够抑制T2DM的胰岛素抵抗大鼠的海马组织内ROS生成，提高SOD活性。红景天苷减少Aβ在脑组织细胞内的异常代谢和沉积，提高神经元清除自由基的能力，从而减轻神经元的损伤，改善T2DM认知功能损伤[17-19]。