丁苯酞诱导缺氧条件下NDUFA4L2蛋白的高表达并参与脑保护的机制

近20年来,缺血性脑卒中的脑保护治疗一直备受全世界脑研究者的关注,但诸多研究结果均未得到充分肯定[1-2],进一步深入研究缺血性脑卒中的损伤与修复机制有着重要的临床意义。 丁苯酞是我国目前应用于临床且被证明可有效改善缺血性脑卒中的新药,多次被急性缺血性脑卒中诊治指南推荐[3-4]。既往多个研究提示其药效机制可能涉及多个病理机制,如细胞兴奋毒性、线粒体及能量代谢障碍、氧化应激、炎症反应等[5-6],其中,线粒体保护、改善细胞能量代谢障碍是非常重要的环节。

NDUFA4L2蛋白是细胞线粒体呼吸链中复合体Ⅰ(Complex Ⅰ)亚基家族中一员[7]。实验研究发现,NDUFA4L2蛋白是唯一一个只存在于线粒体且在低氧环境高表达的ComplexⅠ亚基蛋白,其基因就是低氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1a)的直接目标基因[8]。低氧环境下,嗜铭细胞瘤细胞(PC12)、脑细胞内的线粒体NDUFA4L2蛋白水平均呈高表达趋势,故推测HIF-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ反应轴可能与细胞低氧适应性、细胞损伤保护有关,但至今尚未有相关的报道证实。如前所述,NDUFA4L2蛋白仅在线粒体高表达,那么,丁苯酞的线粒体药效作用机制是否可能与NDUFA4L2蛋白相关?换言之,NDUFA4L2蛋白是否与脑保护机制有关?本研究以PC12细胞为载体,制作PC12细胞缺氧模型,在0、6、12、18、24、48 h不同时间段观察PC12细胞形态变化及NDUFA4L2蛋白表达变化,探索PC12细胞缺氧模型不同时间点NDUFA4L2蛋白表达变化趋势及可能的有效时间窗,以证实NDUFA4L2蛋白对PC12细胞缺氧损伤的保护作用;其次,应用丁苯酞预处理PC12细胞培养基,应用Western blot半定量检测NDUFA4L2蛋白,比较预处理前后NDUFA4L2蛋白变化,以期发现NDUFA4L2蛋白与丁苯酞脑保护作用的关联,为脑保护治疗的基础与临床研究提供部分实验学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 PC12细胞由中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所惠赠;光学显微镜OLMPUS-CKX31(日本OLMPUS公司);1640培养基(GIBCO公司);胎牛血清(GIBCO公司);马血清(GIBCO公司);青链霉素双抗混合液(GIBCO公司);胰酶消化液(GIBCO公司);三气培养箱-3111(美国Thermo公司);NDUFA4L2抗体(Abcam公司);山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor® 647)荧光二抗(Abcam公司);倒置荧光显微镜(莱卡公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo公司);总蛋白提取试剂盒(上海生工生物工程股份公司);DAPI(ROCHE 公司);丁苯酞原液(石药集团恩必普药业有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞培养及细胞形态观察:使用1640培养基+2.5%胎牛血清+12.5%马血清+1%青链霉素双抗混合液作为培养液,PC12细胞培养于37 ℃5%CO2恒温恒湿的细胞培养箱中。在显微镜下观察正常培养细胞形态。

1.2.2 PC12细胞缺氧模型制作、细胞形态观察及标本制作:利用三气箱制作PC12细胞缺氧模型,PC12细胞放置缺氧恒温箱(设置氧浓度为1%)中培养6、12、18、24、48 h,分别观察每个时间段细胞形态、爬片和样品收集。收集到的样品加0.2 mL RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液(含1%的蛋白酶抑制剂),充分吹打后收取蛋白。

1.2.3 Western Blot实验:细胞加含蛋白酶抑制剂的裂解液,4 ℃裂解30 min。裂解完后于4 ℃下12 000 r/min离心10 min,留取上清,通过BCA法测定蛋白浓度。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,孵育一抗(β-actin 1∶5000、E-cadherin 1∶1000、Snail 1∶1000、Twist 1∶1000),孵育二抗(羊抗小鼠1∶10 000;羊抗兔1∶10 000),化学发光法显示结果,曝光,显影定影后扫描。利用Graphpad prism分析软件对实验结果进行分析,以目的条带与内参β-actin的平均吸光度比值表示相对表达水平,进行半定量分析。

1.2.4 丁苯酞预处理:丁苯酞注射液预处理,按不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)分成3组分别加入培养液中,将PC12细胞放置37 ℃5%CO2恒温恒湿的细胞培养箱中培养6 h,缺氧(1%氧浓度)培养12 h,后续进行NDUFA4L2蛋白的Western blot检测。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17软件对多组数据进行单因素方差分析,两两比较采用LSD法,绘图软件为Graphpad prism,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态变化 正常培养的PC12细胞为贴壁细胞,呈较规则圆形,折光度强,成簇生长(图1A)。缺氧6 h(图1B)、12 h(图1C)、18 h(图1D)、24 h(图1E)、48 h(图1F)后,细胞形态逐渐变不规则,折光度减弱,最终细胞固缩,脱落。

2.2 PC12细胞缺氧情况下NDUFA4L2的表达情况 Western blot灰度分析比较提示：6、12、18、24 h NDUFA4L2蛋白水平均明显高于0 h(P<0.05),但NDUFA4L2蛋白表达水平与缺氧时间无明显相关性(P>0.05)。见图2。

注:A:缺氧培养0 h(正常培养);B:缺氧培养6 h;C:缺氧培养12 h;D:缺氧培养18 h;E:缺氧培养24 h;F:缺氧培养48 h。

注:与0 h 比较,*P<0.05，**P<0.01

2.3 丁苯酞预处理后NDUFA4L2蛋白表达情况 使用不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)丁苯酞注射液预处理后，灰度分析提示,与未预处理组相比,丁苯酞预处理后的NDUFA4L2蛋白表达水平均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注:NC:未预处理;与NC组比较,*P<0.05

3 讨论

缺血性脑卒中发生后,血流中断即使是几分钟,核心梗死区也会导致不可逆转的损伤,只有缺血半暗带区可能被神经保护机制暂时保护;氧和葡萄糖因血流中断而缺乏,会即刻在神经元、胶质细胞、血管(即神经血管单元)之间产生大量联级反应性的分子路径[9]。这些环节过程中,线粒体功能非常重要,除了直接影响能量代谢之外,还与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及神经保护密切相关[10]。

NDUFA4L2蛋白是细胞线粒体呼吸链中ComplexⅠ亚基家族中的一员,而ComplexⅠ的含量与缺氧有关，受低氧诱导因子(HIF)调节[11],由于NDUFA4L2 基因仅在线粒体编码,NDUFA4L2蛋白是唯一一个低氧环境高表达ComplexⅠ亚基蛋白[7-8],故备受关注。Tello等[8]提出“线粒体HIF-1a-NDUFA4L2蛋白相关的低氧适应模型”,即缺氧条件下HIF-1a上调线粒体NDUFA4L2蛋白水平,NDUFA4L2蛋白抑制电子传递过程的ComplexⅠ活性,其结果是氧气消耗减少,活性氧(ROS)的产量显著减少,从而使细胞能够适应低氧环境;但是,随着缺氧时间延长,NDUFA4L2蛋白水平也会逐渐下降,这可能是细胞在缺氧条件下于有效时间内的一种自我保护机制。Li等[12]通过缺氧再灌注(hypoxia-reperfusion, H/R)模型模拟心肌缺血/再灌注(ischaemia/reperfusion I/R)损伤模型,证实了NDUFA4L2可以通过Complex Ⅰ来预防心肌细胞凋亡和线粒体功能失调,从而预防H/R损伤。心肌缺血损伤修复与脑缺血损伤修复有类似之处,且缺氧条件下NDUFA4L2蛋白在脑组织中呈高表达水平,因此我们推测,脑卒中后可能也存在HIF-1a-NDUFA4L2-ComplexⅠ保护机制。

PC12细胞作为神经元的前体细胞,能够很大程度地反映神经元在不同状态下的结构和功能变化,并弥补神经元不能传代在实验中所造成的不便制作。所以,利用PC12细胞制作缺氧模型模拟脑缺血性卒中模型是可取的。本研究通过对24 h内PC12细胞缺氧模型不同时间段的NDUFA4L2蛋白Western blot定量检测发现，缺氧24 h内NDUFA4L2蛋白水平普遍增高,但与缺氧时间无相关性,提示24 h内NDUFA4L2蛋白可能对缺氧环境下PC12细胞损伤有保护作用。另外,通过细胞外形观察,缺氧对PC12细胞损伤明显,与时间呈正相关,尤以48 h后细胞损伤显著,贴壁困难,影响48 h以后缺氧模型的建立及相关研究的进行,故本研究主要集中于24 h以内细胞缺氧模型的研究。

丁苯酞在治疗缺血性脑卒中时,其发挥药效的机制多数和线粒体有关[13-14]。NDUFA4L2蛋白作为新发现分子,其作用靶点也与线粒体能量代谢、ROS、细胞低氧适应性有关,与目前研究发现丁苯酞的药效机制有共通之处。本研究中,PC12在不同浓度丁苯酞预处理、缺氧培养12 h后,NDUFA4L2蛋白表达水平均高于未预处理组,提示丁苯酞预处理对缺氧24 h以内PC12细胞损伤有保护作用。NDUFA4L2蛋白可能是其发挥保护作用的关键。

综合实验结果及上述分析,推论HIF-1a-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ路径可能是丁苯酞保护线粒体、抗氧化应激等的药效作用机制之一,NDUFA4L2蛋白可能与脑保护机制有关,NDUFA4L2蛋白相关的HIF-1a-NDUFA4L2蛋白-ComplexⅠ通路可能是脑保护研究的一个新路径或靶点,有进一步探索和研究价值。