CDK4/6抑制剂palbociclib专利技术分析

蒋薇薇

(国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，江苏 苏州 215163)

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，其和细胞蛋白在细胞周期调控中的重要作用，是诺贝尔生理学医学奖获得者在20 世纪70 年代后，经研究才得以发现[1]。CDK作为细胞内重要的信号转导分子，和细胞周期蛋白形成CDK-cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者进入凋亡。CDK家族包括CDK 1～13，cyclin分为cyclin A-L，CDK的不同成员分别与不同的cyclin结合，形成不同的活性复合物，促进细胞周期的转变，调控细胞的转录，以及启动DNA的合成[2-3]。其中，cyclin D家族，在G1期开始表达，结合并激活CDK4和CDK6，形成CDK4/6-Cyclin D复合物，使包括视网膜母细胞瘤蛋白在内的一系列底物磷酸化。Rb被磷酸化后可促进细胞增殖，使细胞周期由G1期向S1期转变。而CDK 4/6抑制剂能够特异性地和cyclin D1结合形成复合物，将细胞周期阻滞于G1期，阻止细胞从G1期进入S期，从而起到抑制肿瘤增殖的作用[4-5]，CDK4/6因此成为抗肿瘤的靶点之一。

目前，经科研工作们的不懈努力，一些著名医药公司陆续报道了一系列选择性较好的CDK4/6抑制剂，主要包括：PD0332991(palbociclib)、LY2835219(abemaciclib)、LEE-011(ribociclib)和P276-00[6-8]。其中，仅palbociclib于2015 年2 月3 日作为乳腺癌治疗药物在美国上市，其余均处于临床研究阶段。

1 Palbociclib的基本概况

Palbociclib(帕博西林、帕博昔里布，结构式见图1)，化学名：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(哌嗪-1-基) 吡啶-2-基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，CAS登记号：571190-30-2，是辉瑞公司(Pfizer)原研开发的全新抗肿瘤药物，其作为目前唯一一个已经上市的CDK4/6选择性抑制剂，用于治疗雌激素受体阳性和人表皮生长因子受体2 阴性晚期乳腺癌，商品名Ibrance。

图1 palbociclib的化学结构式

本文就近年来关于palbociclib的专利申请作技术综述，通过在中文数据库CNABS、外文数据库VEN(由SIPOABS和DWPI组成)两个专利数据库中检索获得进行统计分析的专利样本，检索日期截至2018年12月30日，经过数据整理，得到相关专利文献340余篇。根据上述样本，获得近十几年国内外相关专利申请年度分布如图2所示。

图2 相关专利申请年度分布情况

由图2可见，2003年以前palbociclib的相关专利申请量为0，2003～2010年专利申请数量较少，从2011年开始palbociclib相关专利申请量才有所增加，并从2014年开始迅速增长。这和palbociclib研发历程和上市发展趋势十分一致，虽然palbociclib项目于1995年就被发起，但其于2001年才合成得到，palbociclib的I期试验于2004年开始进行，但当时实验结果表明该药物并没有在I期试验中显示出明显的抗肿瘤效应，当时外界普遍不太看好该药物，这也正对应了自2004年之后几年内palbociclib的相关专利申请量并没有呈现明显增长的趋势。

2 Palbociclib相关专利技术发展路线

自2003年原始专利WO2003062236首次公开palbociclib之后，人们围绕该药物进行了一系列后续研究，主要包括化合物的新晶型、氘代形式，化合物的制备方法及中间体，衍生物，药物组合物，联合用药以及化合物制备方法等几个方面，形成了完整的专利保护链。以下分5个方面进行详细介绍。

2.1 化合物、其盐及晶型 Palbociclib的化合物专利最早是由Warner-Lambert公司(后被辉瑞公司并购，之后palbociclib的化合物专利就属于辉瑞公司)在2003年01月10日申请(WO2003062236)，该专利中具体要求保护了化合物6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(哌嗪-1-基) 吡啶-2-基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，即palbociclib，以及包含该化合物的通式化合物、药物组合物及其制备治疗CDK介导疾病药物中的用途。

化合物的晶型专利是延长化合物专利保护期的有效衍生专利，辉瑞公司于2014年02月08日在国际专利申请WO2014128588中申请保护一种固态形式的palbociclib，包括A型结晶和B型结晶，其中A型为更稳定的晶型。

印度的Sun Pharmaceutical IND公司在WO2016024249中公开了palbociclib的Form Ⅰ、Form Ⅱ、Form Ⅲ、 Form Ⅳ、Form Ⅴ、Form Ⅴ-A、 Form Ⅵ、Form Ⅶ以及Form Ⅷ 9种晶型。

欧洲的SANDOZ AG公司在国际专利申请WO2016066420中公开了一种palbociclib的单盐酸盐晶体。

天津华洛康生生物科技有限公司于CN105085517中公开了一种palbociclib的新晶体：Form I，该晶型相对于WO2014128588中的晶型A和晶型B具有良好储存稳定性，同时在水中和极性溶剂中的溶解度比晶型A和晶型B有明显提高。

此外，为了绕开palbociclib的化合物专利，许多公司也对palbociclib化合物进行了一定的衍生化，如氘代物或盐。Palbociclib的原研公司Warner-Lambert在WO2005005426中针对palbociclib本身存在的水溶性差导致生物利用度较低的缺陷，发明了一种palbociclib的羟乙基磺酸盐，并具体公开了其A、B和D 3种多晶型形式。

郑州泰基鸿诺药物科技有限公司在CN104447739中公开了如图3所示的几种氘代palbociclib衍生物，该发明通过对palbociclib的选择性氘代，改善了药物的药代性质，进而提高了药物的疗效、安全性和耐受性。

2.2 制备方法及中间体 Palbociclib的制备方法最早公开于辉瑞公司的国际专利申请WO2008032157中，该路线以N-Boc保护的哌嗪s-1和2-硝基-5-溴-吡啶s-2为起始原料，经过亲核芳香取代反应，随后在Pd/C氢作用下将硝基还原为氨基得s-4；嘧啶化合物s-5和环戊基胺经过亲核芳香取代反应、Heck反应，随后在醋酸酐催在下脱水缩合成环，进一步溴代得s-8；s-4和s-8通过SNAr反应得到化合物s-9，再和烯基醚通过Heck反应，最后在羟乙磺酸作用下，脱Boc保护基，将烯基醚片段水解至酮以及成盐得到最终的palbociclib，具体如图4所示。

图4 palbociclib的最早专利合成路线

由于上述专利路线主要涉及8步反应，路线较长，总收率低，操作烦琐，原料本身成本较高，此外，该制备工艺中还多次用到了对环境不友好的强腐蚀性的溴素试剂，因而这条合成路线工业化生产难以实现。为此，辉瑞公司在WO2014128588中对原路线进行了一定的改进，主要是将脱保护与成盐步骤改为一锅法完成，并且在氨基吡啶与嘧啶的亲核取代反应中使用强碱氨基锂或异丙基氯化镁，使得总收率提高到43.55%。虽然该方法有所改进，但原合成路线中存在的多个缺陷并未得到实质性的克服。

为了克服上述种种缺陷，科研工作者们主要都是以辉瑞的WO2008032157为基础，对其工艺进行改进以期提供一种集经济、环保、简便等特点于一体的全新palbociclib后续合成路线。结合palbociclib的结构特征，并对WO2008032157中的合成路线进行分析，可见，palbociclib的合成主要体现在母核的形成，取代基甲酰基、环戊烷基以及侧链〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基的引入这4个方面。因而笔者在此基础上对原专利申请以及此后报道的palbociclib制备路线进行归纳，将其主要分为以下5种类型。

2.2.1 以嘧啶类化合物为起始原料，首先引入环戊基，其次形成母核，再引入〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，最后引入甲酰基，其代表性的palbociclib合成路线如图4所示，代表性专利申请如辉瑞公司的WO2008032157和WO2014128588，以及欧洲RATIOPHARM GMBH公司的WO2016030439。

2.2.2 以嘧啶类化合物为起始原料，首先引入甲酰基，其次引入环戊基，再形成母核，最后引入〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路线如图5所示，代表性专利申请如新发药业有限公司的CN104610254。

图5 第一种类型代表性的palbociclib合成路线

2.2.3 以嘧啶类化合物为起始原料，首先引入环戊基、其次引入甲酰基，再形成母核、最后引入侧链〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路线如图6所示，代表性专利申请如上海百奇医药科技的CN104910149。

图6 第一种类型代表性的palbociclib合成路线

图7 第三种类型代表性的palbociclib合成路线

2.2.5 以嘧啶类化合物为起始原料，与含有甲酰基的化合物反应，首先形成带有甲酰基的母核，再引入环戊基，最后引入侧链〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基，其代表性的palbociclib合成路线如图8所示，代表性专利申请如苏州明锐医药科技有限公司的CN104496983A和WO2016082605，江苏中邦制药的CN105153149。

图8 第四种类型代表性的palbociclib合成路线

除上述概括的典型反应之外，一些研究者们还将目光转入到侧链的改进上，如苏州明锐医药科技有限公司的CN104447743A和WO2016082604，山东罗欣的CN105111205，新发药业有限公司的CN104478874和CN104447743，其在引入侧链的同时形成母环结构，大大缩减了工艺步骤，其合成路线示例如图9所示。

图9 引入侧链时成环的palbociclib合成路线

通过对palbociclib相关合成路线的梳理，可见，上述改进后的制备方法均较少使用贵金属钯以及较贵的配体，并减少了相应步骤，同时原料也更为价廉易得。并且，对于palbociclib的制备工艺以及制备中间体的专利申请主要集中在中国。如苏州明锐医药科技有限公司、新发药业有限公司、上海博氏医药科技有限公司、山东罗欣药业集团股份有限公司、北京修正创新药物研究院有限公司等，这也体现了我国在palbociclib原料药生产上的技术优势以及作为主要原料生产国的地位。当然，随着技术的进步和国内外企业研发热情的高涨，相信会有越来越多关于palbociclib的合成工艺被开发出来，进而会有更多原料便宜、过程简略、工艺条件简单的制备方法被应用到工业化生产中，以便能够廉价的生产出大量的palbociclib供市场所需。

2.3 药物组合物及制剂 Palbociclib为难溶性物质，在水中溶解度约9 μg·mL-1，不溶或几乎不溶，这直接影响了该化合物在体内的吸收和生物利用度。为了提高其水溶性，采用现代制剂新技术将其制备成药物新剂型或组合物，是目前专利申请中的常见方式，同时这也是一种快速而又经济的研发途径与专利申请策略。

江苏豪森药业集团有限公司在国际专利申请WO2016070833中利用固体分散技术将palbociclib制备成固体分散体，并进一步与崩解剂、稀释剂、黏合剂、润滑剂以及助流剂组合。经大量实验后发现，该组合物能够显著的增加药物的溶解度，增加药物的吸收和改善药物体内的生物利用度。该公司还在WO2016070834中提供了一种适合医药应用的palbociclib，该药物制剂具有有益的溶出行为和好的稳定性。此外，国内的其他公司也公开了多种将palbociclib或其盐与不同的药物载体组合，进而制备成适应临床应用的一般药物制剂，如南京正大天晴的CN105213322。

东南大学在CN105457038中公开了可将palbociclib制备成一种速释型药物磷脂化合物，进而再将其与合适的组合制备成一种药物组合物，该速释型药物磷脂化合物及其脂质体纳米颗粒可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂，毒性低，可用于各种肿瘤等疾病的高效治疗。此外，该高校还在CN105288648中公开了可将palbociclib制备成一种亲水性磷脂化合物，并可由此制备得到一种粒径为10～1 000 nm的脂质体纳米颗粒，该脂质体纳米颗粒同样可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂，毒性低，可用于各种肿瘤等的高效治疗。

上海鲁源医药在CN104887641中采用泡腾和非泡腾两种漂浮机理设计而成一种palbociclib胃漂浮片；北京康立生在CN104892604中制备得到了一种palbociclib缓释制剂；美国佐尼奥尼制药公司在WO2014121211中公开了可将包含palbociclib在内的一些低水溶性的抗肿瘤药物制备成脂质体。

由上可知，在制剂新技术、新设备以及新辅料快速发展的现代，人们大力开发palbociclib新制剂的基础上，对于palbociclib制剂的研究并未随着新剂型的出现而消失，仍有大量传统制剂被申请。然而不可否认的是，新制剂的种类相对较为丰富，涉及水溶性包合物、固体分散制剂、微球、纳米粒、脂质体等。这也说明，palbociclib新制剂的发展越来越受到科研工作者的重视。虽然目前市场上销售的palbociclib药物制剂为口服胶囊制剂，其存在制剂技术水平低、服用顺应性差、生物利用度低等缺点，但是随着现代制剂新技术、新设备以及新辅料的快速发展，必将会有更多的palbociclib的新制剂突破实验室研究，进而服务于临床，并且随着这些新剂型的产业化，开发palbociclib用于癌症等其他新适应证的缓控释制剂、靶向制剂等，也将具有极好的市场前景。

1.1.2 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅（上海东亚容器01J2003－04）、超低温冰箱（SANYO MDF－392）、冰箱 （Hair208K ／ANCINA）、制 冰 机 （SCOTSMAN DA24845－3）、PCR 扩增仪（德国 Eppendorf 5331）；高速低温离心机（德国Eppendorf 5417R）、电泳仪（北京六一DYY－4C）、涡旋振荡器（美国 Scientific Industries Vortex－Genie 2）、电子天平（赛多利斯Secura®）、凝胶成像系仪器（美国伯乐 Gel Doc 200）、超微量紫外可见分光光度计（北京普析TU－1810）。

2.4 新用途或药物联用 虽然palbociclib上市时适用于有雌激素受体(ER)-阳性，人表皮生长因子受体2(HER2)-阴性晚期乳癌绝经后妇女的治疗。然而究其根本，palbociclib的作用机制在于其能高选择性地作用于cyclinD/CDK，抑制CDK4和CDK6的活性，因此，抑制Rb蛋白的磷酸化而导致细胞周期的阻滞。由于几乎所有肿瘤细胞都存在细胞周期的异常调控所导致的异常增殖，因此，已有研究将PD-0332991作为抗肿瘤药物，单独或联合其他化疗药物，应用于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等的治疗的临床实验。天津医科大学总医院在CN104758292中公开了一种PD-0332991在制备防治耐药肿瘤药物的用途，其运用细胞生物学和分子生物学方法，以及在人吉非替尼耐药的裸鼠移植瘤模型的试验证明，PD-0332991能有效抑制人吉非替尼耐药肺癌细胞生长，诱导凋亡，调控细胞周期相关基因，引起肿瘤细胞周期停滞，诱导凋亡，因此，可以将PD-0332991作为有效成分，制备防治吉非替尼耐药肿瘤药物及防治耐药肿瘤食品、保健品及化妆品。

美国的阿拉贡药品公司在WO2014113260中，将雄激素受体调节剂与palbociclib联用，用于治疗前列腺癌和用于治疗适合于使用雄激素受体调节剂治疗的疾病或病症。普莱希科公司在WO2013142427中将palbociclib与其他化合物联用用于治疗与Fms蛋白激酶及其任何突变体、Kit蛋白激酶及其任何突变体、Flt-3蛋白激酶等相关的疾病。

北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校在palbociclib新用途开发方面作出了杰出贡献，其分别在国际申请WO2012068381、WO2010132725、WO2010051127、以及WO2010039997中公开了palbociclib的4种新用途。其一是向已暴露于局部缺血或有局部缺血的风险的个体给给予palbociclib，可保护细胞和或组织免受由于局部缺血的损伤；其二是向已暴露于或有风险暴露于DNA损伤的个体给予palbociclib，可保护健康细胞免受归因于DNA损伤剂的损伤；其三是使用palbociclib来诱导CDK4/6依赖性细胞例如造血干细胞和/或造血祖细胞中的暂时静止，通过在暴露于所述电离辐射之前、同时或之后用palbociclib治疗可以实现在哺乳动物中的辐射防护；其四是使用palbociclib来诱导CDK4/6依赖性细胞例如造血干细胞和/或造血祖细胞中的暂时静止，由此减轻或预防细胞毒性剂化合物在健康细胞中的效应。

由于药物新用途是延长和拓展药物专利有效性的重要手段，相信随着分子生物学的进步和对于palbociclib作用机理研究的进一步深入，日后必定会有越来越多涉及palbociclib新用途的专利申请被提出来，进而使得palbociclib在药物治疗领域焕发出引人注目的新篇章。

2.5 结构改造 众所周知，想要改良化合物的成药特性，最直接的方式即是对其化学结构进行改造，从根本上改变其各项性质。Palbociclib为难溶性物质，导致其体内吸收差以及生物利用度低的缺点是本领域公认的事实，正因为此，科研工作者们才有动机以palbociclib为先导化合物，进而对其进行结构修饰与改造，以期得到性质更好的化合物。

在palbociclib结构改造方面，广东东阳光药业有限公司做了重大努力，其先后在WO2016008433、WO2016015597、WO2016015598、WO2016015604、WO2016015605等国际专利申请中公开了对palbociclib的结构改造，其中最为典型的是WO2016015597，该申请中涉及的改造位点即为侧链5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基，经实验证明其申请中通式结构内的部分化合物对CDK4、CDK6激酶均有较强的抑制作用，且化合物的体内代谢较好，有较好的吸收和暴露量，生物利用度较高。美国的Concert Pharmaceuticals Inc在WO2014150925中也公开了对palbociclib的结构修饰，该申请在对palbociclib环上的氢原子进行部分氘代的同时，还对其母环上的5-位甲基、6-乙酰基以及吗啉环上的4位基团进行了结构修饰。

对涉及palbociclib结构修饰的申请进行梳理，笔者发现，目前涉及的palbociclib结构修饰，多集中于palbociclib本身具有的取代位点，如5-位甲基、6-乙酰基等。事实上，根据palbociclib的化学结构所示，其上可供修饰的位点众多，对于开发与palbociclib结构类似的CDK4/6抑制剂而言，虽然采用本领域常见的常规基团对先导化合物进行改造能够极大地丰富化合物的种类，并且其制备方法也可以参照现有技术进行，采用本领域常规的反应方法即可制得，然而基团改造后得到化合物的活性有待考证，并不是所有改造后的化合物均具有或者更好的抗肿瘤活性，其需要实验的验证。Palbociclib作为一个刚刚上市不久的新药，其衍生物在后续的申请中必然会越来越多。

3 结语

从技术发展脉络看，围绕palbociclib进行的后续专利申请主要涉及新晶型、制备方法和工艺、药物组合物、药物制剂以及结构改造等，这与药物研发的一般思路一致。对于化合物及其制备方法而言，尽管palbociclib的相关核心专利技术(如化合物专利、晶型专利等)还主要掌握在原研公司辉瑞公司手中，但我国企业的药物研发能力逐渐成熟，同时拥有明显的原料药生产优势，这点从关于palbociclib的制备方法专利主要集中在中文专利中也可以看出，因此随着palbociclib化合物专利的到期，相信palbociclib的本土化趋势将不断加强。

对于palbociclib晶型而言，虽然已有多个药企对此进行了研究，但笔者认为，目前已有晶型表现出来的性质并没有好到没有上升空间的程度，因而在palbociclib的后续开发中，国内企业可以朝着更加稳定的palbociclib晶型或者其溶剂合物晶型的方向进行，这样不仅能够拥有自主知识产权而且还能绕开包括原研公司在内的已有效专利保护的晶型产品。此外，化合物的无定形形式也是药用化合物的常见的固体形态，一些药物的无定形形态在外观、溶解度、熔点、溶出度、稳定性、生物利用度、生物有效性等方面相对于晶型形式更具优势，因而国内药企还可以适当关注palbociclib的无定形形式，从这个方面入手可能会获得具有自主知识产权的成药性更好的palbociclib产品。

对于palbociclib的新制备方法，国内的一些企业已经开发了多种高效、绿色经济的制备方法，但这些方法大多数还局限于在WO2008032157基础上进行的基团引入或成环次序的改进，这些方法均为涉及基团本身的改变。事实上，我们可以打破传统，从化合物的结构出发，并根据化合物逆合成原理来进行分析，不一定非要局限于基团的引入或者成环次序的先后，可以从形成基团或者母环本身的步骤进行，如苏州明锐医药科技有限公司就突破常规，对侧链〔5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基〕氨基进行了改进，并以此为基础来形成母环，这样不仅大大缩减了工艺步骤还节约了大量的生产成本。

对于palbociclib的药物组合物或制剂，目前开发的产品中基本上已涉及了药物制剂中的主要新技术，即固体分散体制备技术、包合物制备技术、聚合物胶束以及脂质体与泡囊制备技术。采用上述制剂新技术即可制备得到多种多样不同的药物新剂型，然而目前提及的palbociclib药物制剂仅为药剂学领域多种剂型中的一部分，因此palbociclib药物新剂型的开发还可以从口服定时释药系统、免疫纳米球、磁性微球或纳米粒、pH敏感的靶向制剂等几个方面着手。

对于palbociclib与其他药物的联用，目前主要是将palbociclib与其他已经抗肿瘤药物进行联用，但实质上，药物的联用并不局限于相似药理活性的药物联用，将不同药理活性的两种药物进行联用可能或取得预料不到的效果，因而在palbociclib的后续药物联用开发中，我们可以从更微观的机理上分析，以开发出更多合适的联用产品。

对于palbociclib的结构改造，根据palbociclib的结构分析可知，其上可供修饰的位点众多，化合物众多位点以及多个活性官能团的存在为科研工作者们提供了极大的化合物改造空间，并且除了不同位点和活性官能团的改造外，改造骨架环系结构中的不饱和位置也是本领域技术人员在寻找性质更好的抗肿瘤化合物的常规手段。

虽然，palbociclib未来十几年仍在专利保护期内，但其骄人的光环将继续吸引人们围绕该化合物进行开发，新合成方法、衍生物、开发更多新剂型以及针对新适应证的药物联用成为该品种未来技术发展的方向；另外，研究表明，CDK4/6抑制剂有着特异的选择性，不仅能区别常见的丝/苏氨酸激酶，而且能区别其他类型的CDK，因而palbociclib作为最为典型的CDK4/6抑制剂未来在抗肿瘤领域必将会有很好的市场前景。