大豆分离蛋白基共聚物SPI/AGC水凝胶的制备研究

杨英，杨艳丽

(甘肃省医疗器械检验检测所，甘肃 兰州 730050)

中国是大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]种植和进口大国，中华人民共和国海关总署统计“十三五”期间我国大豆进口超过8 500万吨/年，国家粮油信息中心估计2019年种植面积达1.3亿亩，产量1 200万吨以上。我国已经形成食品制作、榨油、养殖饲料等比较完善的大豆产业链，但加工过程中产生的大量豆渣、豆皮等工业副产品，由于其利用途径合理性欠缺，在某种程度上造成了资源浪费，其资源综合利用亟待提质增效。

豆渣主要成分是大豆蛋白(soy protein，SP)，可分离得到大豆分离蛋白(soy protein isolate，SPI)，SPI系全价蛋白类食品添加剂，是为数不多的可替代动物蛋白的植物蛋白品种，独特的化学结构特性，赋予其多种优良材料特性，如结膜、发泡、凝胶、吸油、水合、乳化、无毒可食、生物相容、高机械强度，可作为优良的药物释放系统、农业保湿等生物材料。本研究通过跨行业、跨领域的关键技术，采用提质增效模式，拓展了大豆豆渣工业副产品资源高质化应用领域，将有利于提升我国大豆产业链技术水平、扩容产业链中下游涵盖领域、增强产业链韧性。

1 材料与仪器

1.1 材料 大豆分离蛋白(SPI，南宁庞博士生物工程有限公司，批号：9010-10-0)；丙烯酰胺(AM，山东瑞海米山化工有限公司，批号：79-06-1)；过硫酸铵(APS，莱阳双双化学厂，批号：7727-54-0)；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA，天津市化学试剂研究所，批号：110-26-9)；壳聚糖(CS，山东奥康生物科技有限公司，批号：9016-76-4)；醋酸(乐山东承新材料有限公司，批号：33-87-001)；无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司，批号：20160606)。

1.2 仪器 Agilent 8453紫外-可见分光光度计(Agilent Technologies)；FD-1D-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；FTS3000红外光谱仪(美国DigiLAB Merlin)；Pyris Diamond(热重分析仪；PerkinElmer)；JSM - 6701F扫描电镜(日本电子光学公司)。

2 方法

2.1 大豆分离蛋白/丙烯酰胺和壳聚糖共聚物(SPI/AGC)水凝胶的制备 0.1 g CS粉末，溶于6 mL 2%醋酸溶液，搅拌10 min；量取10 mL SPI分散液(0.5 g SPI分散于5 mL 8 mol·L-1尿素溶液)，并依次加入 0.5 g AM、0.1 g MBA，通N2，搅拌30 min。升温至65 ℃，加入溶解0.03 g APS的1 mL二次蒸馏水，搅拌5 min，转入圆柱瓶，置于65 ℃水浴锅4 h，得淡黄色SPI/P(CS-g-AM)水凝胶(即大豆分离蛋白基共聚物水凝胶，缩写为SPI/AGC，其中CS-g-AM共聚物，缩写为AGC共聚物)，将制备的SPI/AGC水凝胶置于乙醇(30 mL)中浸泡12 h(每2 h换一次乙醇)，继续浸泡过夜(12 h)，共计24 h。次日，在二次水中浸泡12 h(每2 h换一次水)，继续浸泡过夜(12 h)，共计24 h。将除去杂质的SPI/AGC水凝胶在冷冻干燥机中干燥，直接得到最终固体产品SPI/AGC干凝胶。

2.2 SPI/AGC水凝胶的结构形态 不同状态的SPI/AGC水凝胶在室温下分别照相，得其形貌结构图。

3 结果与讨论

3.1 SPI分散性考察 球蛋白(约90%)和清蛋白(5%)是SPI的主要成分，球蛋白分子为椭球状实体或紧密球状，空间结构折叠，肽链上疏水侧链基团埋藏在分子内部，亲水性分子(盐键、酯键等)基团暴露表面，只有当亲水性基团暴露出来，才能对SPI进行改性。由于SPI分子由氨基酸通过肽键缩合而成[1]，SPI在等电点附近几乎不溶，但当pH超过等电点，分散性随着pH升高而增大，SPI分子内氨基酸氨基与羧基的电离性，但较低pH时碱性氨基酸支链功能基及酸性氨基酸羧基质子化，使蛋白质带正电荷；较高pH时质子从碱性与酸性功能基被移除，使蛋白质带负电荷[2]。蛋白质带电荷不同，性质不同，溶液中的三维结构也不同，故溶解度不同。试验表明，SPI在二次蒸馏水中不分散，而在0.1 mol·L-1NaOH溶液或者8 mol·L-1尿素溶液中分散性良好，高分子链处于松弛状态(见图1)。

图1 SPI在不同介质中的分散性

3.2 SPI/AGC水凝胶的制备机理 蛋白分子间主要结合力为氢键、二硫键、疏水键等。大豆球蛋白有酸性多肽链和碱性多肽链各一条，多肽链间二硫键连接[3]。β-伴大豆球蛋白是三聚体糖蛋白，由α，α′和β 3种亚基组成，有7种不同组合，亚基通过疏水键和氢键连接[4]。分散后的SPI骨架上有大量亲水性基团，如-NH2、-COOH、-OH等，可与AM、CS共聚物(AGC)上的活性基团发生氢键或非共价键相互作用。因此，亲水性聚合物AGC分布于SPI构成相互贯穿的聚合物网络，从而大分子在三维空间中以不同的镶嵌方式构成连环体。以MBA为交联剂，APS为水溶性氧化还原引发剂，将SPI与AM、CS以不同比例共混，引发功能性单体CS和AM在水溶液中原位聚合，制备SPI/AGC水凝胶(见图2)。

图2 CS-g-AM接枝反应方程式

3.2.1 不同原料比例对SPI/AGC水凝胶成型和性能的影响 功能性单体与SPI比例对合成SPI/AGC水凝胶性能影响很大。为了优化合成条件，选取如表1所示比例，考察合成条件。各组样品形貌结果如表1，发现当SPI比例越大，凝胶成形性越差；该反应制备SPI/AGC水凝胶结构比较复杂，溶胀比与溶胀率均降低；其中SPI/AGC-3水凝胶组样品成胶性和弹性均好。

表1 SPI/AGC水凝胶比例对凝胶性能的影响

图3 SPI/AGC水凝胶比例对凝胶性能的影响

3.2.2 交联剂用量对SPI/AGC水凝胶的性能影响 交联剂不同浓度条件制备SPI/AGC水凝胶，性能迥异，随着交联剂量增加，SPI/AGC水凝胶中交联点增多，高分子链结合密度增加，使水分子更难进入凝胶网络，导致SPI/AGC水凝胶的平衡溶胀率越来越低。选择3组不同浓度交联剂的制备条件，考察交联剂浓度对水凝胶成形性与溶胀度的影响，结果如表2。综合考虑，SPI/AGC-j2水凝胶组交联剂浓度下，制备SPI/AGC水凝胶成型性较优。

表2 交联剂浓度对SPI/AGC水凝胶性能的影响

3.2.3 温度和时间对SPI/AGC水凝胶成型影响 选3组不同反应温度试验，考察了反应温度对互穿网络水凝胶合成影响。研究发现，当温度高于80 ℃时，SPI发生急剧变性而变成絮状物，不能分散，反应无法进行，温度低于60 ℃时，不能引发产生自由基，聚合不能发生，65 ℃为最适聚合温度。

选3组不同反应时间试验，考察时间对水凝胶成型性与溶胀度的影响，结果如表3。试验观察到SPI/AGC-t1水凝胶不成胶、SPI/AGC-t2水凝胶未完全成型，说明单体和蛋白未完全反应，而SPI/AGC-t3水凝胶聚合反应完全，成型状态完好。

表3 时间对SPI/AGC成型的影响

3.3 SPI/AGC水凝胶形态与结构表征

3.3.1 SPI/AGC凝胶形态 制备的SPI/AGC水凝胶经乙醇和二次蒸馏水洗涤，除去未反应单体和其他杂质。经乙醇浸泡SPI/AGC水凝胶体积缩小，二次蒸馏水浸泡后溶胀体积变大。在冰箱中冰冻过夜，冷冻干燥后SPI/AGC水凝胶呈疏松孔状，形貌结果如图4。

图4 SPI/AGC水凝胶在不同介质中的形貌

3.3.2 SPI/AGC水凝胶的红外光谱(FT-IR)谱图 如图5，1 650 cm-1和1 600 cm-1吸收分别为CS中酰胺的酰胺Ⅰ带吸收，即C=O伸缩振动和N-H弯曲振动吸收,而CS-AM接枝共聚物除3 450 cm-1附近出现-OH的O-H、-NH2的N-H伸缩振动吸收外，1 668 cm-1有强吸收,为-CONH2特征吸收。说明接枝共聚反应后引入了酰胺基团。同时-NH-弯曲振动峰从1 380 cm-1和1 425 cm-1红移到1 414 cm-1和1 455 cm-1,说明AM在CS主链上形成接枝共聚物。

如图6，3 373 cm-1附近N-H和O-H伸缩振动峰，1 652 cm-1酰胺Ⅰ带吸收为蛋白质酰胺键C=O伸缩振动吸收，1 554 cm-1呈酰胺Ⅱ带特征吸收峰，为N-H弯曲振动。1 215 cm-1C-N伸缩振动酰胺Ⅲ带吸收。SPI和AGC对比，SPI/AGC水凝胶在1 718 cm-1附近出现AGC中C=O伸缩振动吸收峰，同时在1 650、1 538、1 215 cm-1附近出现SPI酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带特征吸收峰，SPI/AGC水凝胶酰胺特征吸收带有所增高即可初步推断SPI经改性后蛋白质内部可能形成新的氢键，表明本法制备SPI/AGC水凝胶成功。

3.3.3 SPI/AGC水凝胶的扫描电镜(SEM) 如图6，SPI球状结构、大小不均一、形状不规则，AGC共聚物光滑的片状结构、表面呈不规则孔状结构，而SPI/AGC水凝胶表面呈规则孔状结构，其形貌明显比AGC共聚物更易负载染色剂。

3.3.4 SPI/AGC水凝胶的热重分析(TG) SPI、AGC共聚物和SPI/AGC水凝胶经冷冻干燥后，热重量分析实验条件为N2保护，升温范围25～800 ℃，升温速度10 ℃·min-1(见图7)。

图5 SPI/AGC水凝胶、SPI及AGC共聚物的FT-IR谱图

图6 SPI/AGC水凝胶、SPI粉及AGC共聚物的扫描电镜图

图7 SPI/AGC水凝胶、SPI和AGC共聚物的热重分析

微商热重分析表明，SPI/AGC水凝胶作为释放系统或保湿材料，其释放过程比SPI和AGC共聚物更敏感、稳定、可控，有智能特性。

4 结论

本研究以SPI为基材，AM和CS为功能性单体，以水溶性APS为引发剂，MBA为交联剂，利用原位聚合原理，制备SPI/AGC水凝胶，采用FT-IR、SEM和TG对SPI/AGC水凝胶表征结构形貌等。表明本水凝胶制备成功，其相容性好[5]。该水凝胶可作为药物载体可保持药物分子的活性，对药物有很好的控制释放性能，作为药物运输系统有很好的发展前景[6-7]。