宫颈鳞癌新辅助化疗前后P-gp、MRP1、Survivin对临床疗效的预测作用

陈 芬 彭瑞宇 王亚林 张丽萍，3

1 湖北医药学院附属太和医院，湖北省十堰市 442000； 2 昆明爱维艾夫医院； 3 华中科技大学同济医院附属武汉儿童医院

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，近年发病呈年轻化趋势[1]。宫颈癌传统的治疗方法主要采用手术治疗和放射治疗：早期患者主要采取手术治疗，中晚期患者主要采取放射治疗。在宫颈癌的治疗方法中，新辅助化疗(NACT)逐渐成为研究的热点，其优点在于：缩小局部病灶、减轻宫旁浸润、消除亚临床病灶及增强其对放疗的敏感性等。化疗虽然在一定程度上可以提高治疗效果，可是由化疗产生的耐药性是导致化疗失败的关键原因之一。因此探讨与耐药相关的蛋白对于选择敏感的化疗药物，提高化疗疗效成为治疗局部晚期宫颈癌患者的关键因素。P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、生存素(Survivin)是最近研究较热的与耐药相关的基因蛋白，但是关于三者在宫颈癌中的联合检测少见报道。本课题采用免疫组织化学和自动图像分析系统，检测宫颈鳞癌新辅助化疗前后三者的表达，探讨三者能否作为预测宫颈癌新辅助化疗的参考指标，进而为宫颈鳞状癌患者采取有效化疗方案和提高近期临床疗效提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集我院2016年2月—2017年3月间经本院病理科活检确诊为宫颈鳞状细胞癌患者的标本，其中符合在本院行新辅助化疗前均未行任何化疗、放疗和免疫治疗的初治患者，及新辅助化疗后行手术切除的石蜡配对标本共30例。所有患者的病理切片均由资深病理科专家复阅宫颈癌HE病理切片并再次确诊。采用国际妇产科联盟(FIGO，2009)子宫颈癌临床分期标准[2]：宫颈癌Ⅰb2期10例，Ⅱa期20例。且均符合：为初治患者(未接受过化疗、放疗和免疫治疗)；患者年龄在26～64岁之间，平均年龄为46.24岁；癌灶直径≥4cm；血WBC≥4×109/L，PLT≥100×109/L；心肺肝肾及凝血功能均无异常；无其他恶性肿瘤病史。所选病例均行开普拓联合顺铂静脉滴注的化疗方案[3]，具体用法：CPT-Ⅱ60mg/m2,化疗第1、8、15天静脉滴注；DDP 60mg/m2,仅第1天静脉滴注，并常规水化。每个疗程间隔时间28d。化疗1个疗程后观察患者的近期临床疗效。化疗总疗程结束后14d，各项生化指标恢复接近正常水平时，行广泛全子宫切除及盆腔淋巴结清扫术，并留取组织石蜡封存。

1．2 实验方法和主要试剂 采用免疫组化S-P法及自动图像分析系统来检测。将选取的石蜡包埋组织，于冰箱冷冻，然后于切片机上连续切取3～4μm厚的组织切片，用胶片捞起，烘干冷却后，经脱蜡和水化等处理后，微波抗原修复，均按试剂盒步骤操作。P-gp、MRP1单克隆抗体及Survivin多克隆抗体及SP试剂盒均购于福建迈新生物科技有限公司。分别用PBS缓冲液代替3种一抗作为阴性对照，并用已知的阳性病理切片作为阳性对照片。运用Image Pro Plus 6.0自动图像分析系统,于×200倍镜下，提取阳性细胞,测定平均光密度值(OD)。

1.3 染色阳性结果和判定 (1)免疫组化结果判定标准：P-gp、MRP1阳性染色颗粒位于胞膜和(或)胞浆中， Survivin阳性染色颗粒定位于细胞浆。阳性结果为胞膜和(或)胞浆中出现淡黄至棕黄色颗粒为阳性。(2)免疫组化阳性信号的图像分析：运用Image Pro Plus 6.0自动图像分析系统,于×200倍镜下，随机选取5个视野,系统自动随机测定每个视野3个不同的部位,最后提取阳性细胞,测定平均光密度值(OD) 。(3)临床疗效的判定标准为：主要以直接观察宫颈癌灶的大小变化，及参照阴道B超所测得子宫颈癌灶大小的变化，来判断其行新辅助化疗后的临床疗效。根据国际抗癌协会(UICC)疗效判定标准：完全缓解(CR)：可见的肿瘤病变完全消失，维持4周以上；部分缓解(PR)：肿瘤病灶的最大直径及其最大的垂直横径的乘积缩小>50%以上，其他病灶无增大，无新病灶出现，维持4周以上；稳定(SD)或无变化(NC)：肿瘤病灶的两径乘积缩小不足50%，或增大不超过25%，无新病灶出现，维持4周以上；进展(PD)：肿瘤病灶的两径乘积增大25%以上或出现新病灶。临床有效=CR+PR；临床无效=SD+PD。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌新辅助化疗前、后P-gp、MRP1、Survivin 的表达 P-gp化疗后的表达量显著高于化疗前，差异有统计学意义(P<0.01)；MRP1化疗后的表达量虽然高于化疗前水平，但是差异无统计学意义(P>0.05)；Survivin化疗后的表达量显著低于化疗前水平，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 宫颈鳞癌新辅助化疗前后P-gp、MRP1、Survivin的表达

2.2 P-gp、MRP1、Survivin与宫颈癌患者临床病理因素的关系 P-gp和MRP1与宫颈鳞癌的FIGO分期、病理学分级及盆腔淋巴结转移均无关(P>0.05)；Survivin与宫颈癌的FIGO分期、病理学分级无关(P>0.05)，但是与盆腔淋巴结转移相关(P<0.05),即宫颈鳞癌患者中有盆腔淋巴结转移者其Survivin表达量高于无盆腔淋巴结转移者。见表2。

表2 P-gp、MRP1、Survivin与宫颈鳞癌患者临床病理因素的关系达

注：带☆者为P<0.05，余P>0.05。

2.3 P-gp、MRP1、Survivin的表达对新辅助化疗近期临床疗效的预测 新辅助化疗有效组中P-gp的表达量显著低于无效组；新辅助化疗有效组中MRP1的表达量与无效组中MRP1的表达量无差别；新辅助化疗有效组中Survivin的表达量显著低于无效组。 见表3。

表3 化疗后P-gp、MRP1、Survivin的表达与近期临床疗效之间的关系

注：带☆者为P<0.05，余P>0.05。

3 讨论

宫颈癌的传统治疗方法是根治性手术和放化疗，Ⅰa期～Ⅱa期患者以手术治疗为主，其优点是年轻患者可以选择性的保留卵巢和阴道的部分功能；Ⅱb期及以上者以放疗为主；晚期和复发转移的患者，主要采取化学疗法。新辅助化疗技术取得了较好的疗效，使得肿瘤体积减小，分期降低，再行手术切除，可显著提高手术质量和术后疗效[4]。化疗虽然可以提高治疗效果，可是由化疗产生的耐药性是导致化疗失败的关键原因之一。对化疗不敏感的患者实施 NACT 将导致治疗延误，并带来不良反应，加重患者的经济负担[5]。因此探讨与耐药相关的蛋白对于选择敏感的化疗药物，提高疗效成为治疗局部晚期宫颈癌患者的关键。

P-gp是一种能量依赖性的，具有跨膜外排泵作用的糖蛋白，是多药耐药基因 MDR-1 的编码产物，经 ATP 水解供能将药物主动转运出胞外，最终导致肿瘤耐药[6]。P-gp在宫颈癌组织中的高表达，提示其在宫颈癌癌变耐药的产生过程中发挥重要作用[7]。Konishi等[8]采用免疫组化方法检测47例行新辅助化疗的宫颈癌组织中P-gp的表达，并分析影响宫颈癌预后的临床病理学因素，识别预测宫颈癌化疗反应的化疗耐药性指标，结果显示宫颈癌组织中P-gp的表达率为32%，尽管P-gp的表达与组织学类型、宫旁浸润及淋巴结转移无关，但是P-gp的表达水平与宫颈癌患者的化疗反应密切相关，表达水平越高化疗反应越差(P<0.05)。本研究结果表明，宫颈癌化疗有效组P-gp的阳性表达量低于化疗无效组，差异有显著统计学意义(P<0.01)。由此说明，P-gp在宫颈鳞癌组织中的表达水平与新辅助化疗疗效密切相关，其表达水平越高，新辅助化疗的效果越差，与Konishi[8]报道一致。本实验也证实了P-gp的表达与宫颈鳞癌的FIGO分期、病理学分级及盆腔淋巴结转移无关，从而推测P-gp的表达与宫颈鳞癌恶性程度关系不大。

MRP是一种跨膜转运糖蛋白，介导肿瘤细胞的多药耐药，目前已发现 9 个成员，其中MRP1与肿瘤的多药耐药关系最为密切[5]。彭君臣等[9]研究显示宫颈鳞癌新辅助化疗前后MRP1阳性表达率均高，分别为86.7%、93.3%，两者无显著性差异；新辅助化疗前宫颈鳞癌MRP1表达阴性和阳性患者有效率无显著性差异(P>0.05)；认为MRP1不能作为预测化疗疗效的一个指标。本研究发现，宫颈鳞癌新辅助化疗有效组阳性表达平均光密度值为0.386 9±0.003 5；化疗无效组中，MRP1平均光密度值为0.376 5±0.006 2，差异无统计学意义(P>0.05)。说明MRP1不能作为判断宫颈鳞癌新辅助化疗是否有效的指标，与彭君臣等[9]报道一致。但也可能与本研究例数较少有关，同时实验也显示MRP1的表达与宫颈鳞癌的FIGO分期、病理学分级及盆腔淋巴结转移无关。因此，由MRP1介导的多药耐药机制尚需大样本对照进一步研究。

Survivin在宫颈癌中高表达[10]，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin蛋白在有丝分裂过程中促进转化细胞的异常增殖，从而使其表现为过度表达，抑制凋亡[11]。研究发现，大部分抗肿瘤药物是通过细胞凋亡发挥抗肿瘤效应，最后导致肿瘤细胞死亡的。Survivin在组织中的表达具有很明显的特点，在正常组织无表达或低表达。宫颈癌组织中高水平的 Survivin 表达可致宫颈癌细胞凋亡抑制、细胞周期改变，癌细胞增殖过度，癌组织新生血管增多，导致肿瘤发生、进展[12]。于春霞等[13]选取50例宫颈癌患者作为研究对象，该研究中新辅助化疗后的 Survivin 阳性率(34.00%) 显著低于化疗前(78.00%)。本研究表明化疗有效组Survivin的表达量显著低于化疗无效组，且化疗后的表达量显著低于化疗前水平，差异有显著统计学意义(P<0.01)。从而推测宫颈鳞癌组织中Survivin的高表达使得肿瘤细胞的抗凋亡作用增强，进而导致癌组织对化疗药物耐药性增强。Survivin与宫颈癌的FIGO分期、病理学分级无关(P>0.05)，但是与盆腔淋巴结转移相关(P<0.05)。即宫颈鳞癌患者中有盆腔淋巴结转移者Survivin的表达量高于无盆腔淋巴结转移者，因此推测Survivin基因的表达可能在一定程度上反映宫颈鳞癌患者的恶性程度。

本研究为小样本研究，初步表明P-gp、Survivin对宫颈鳞癌患者新辅助化疗是否有效有一定的预测作用。但是由于本研究的样本例数较少，其临床价值和意义需要大样本多中心对照研究。

综上所述，通过联合检测宫颈鳞癌组织中的多种耐药及相关基因蛋白，可以在一定程度上预测宫颈鳞癌新辅助化疗的有效性，从而更好地指导临床化学用药。对不同的人群，选择合适的化疗药物，制定合理的个体化治疗方案，对保证良好的治疗效果及提高患者的生活质量具有非常积极的指导意义。