慢性应激致抑郁小鼠不同组织C型钠尿肽表达的变化

任敬一 付媛媛 荆潇橦 苏玉娇 史晓瑞 杜玉茹 史海水

[摘要] 目的 探讨慢性应激致抑郁小鼠不同组织和血清中C型钠尿肽（CNP）表达的影响。 方法 选取20只雄性ICR小鼠，并按照随机数字表法将其分为对照组和应激组，每组10只。采用慢性轻度应激（CMS）方法建立抑郁小鼠模型，经动物行为学检测后取材，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法对小鼠海马、肝、肾、心和血清中CNP进行定量分析。 结果 行为学测试结果显示，与对照组比较，应激组小鼠糖水偏爱值明显减小，强迫游泳测试、悬尾测试的不动潜伏期明显缩短，强迫游泳的不动时间明显延长，差异均有统计学意义（P < 0.05）;两组小鼠总摄水量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，应激组小鼠心、肾和血清中CNP水平明显升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 慢性应激可引起心、肾和血清中CNP水平显著升高，提示外周组织的CNP表达变化可能与应激致抑郁的发生发展有关。

[关键词] 抑郁症;慢性应激;钠尿肽;C型钠尿肽

[中图分类号] R395          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（a）-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of C-type natriuretic peptide （CNP） expression in different tissues and serum of mice with chronic stress-induced depression. Methods Twenty male ICR mice were selected and divided into control group and stress group according to the random number table method with 10 mice in each group. Chronic mild stress （CMS） method was used to establish depression mice model. After animal behavior test， samples were taken and the levels of CNP in hippocampus， liver， kidney， heart and serum were quantitatively analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The results of behavioral test showed that compared with the control group， the preference value of sugar and water in stress group was significantly reduced， the immobility latency of forced swimming test and tail suspension test were significantly shortened， and the immobility time of forced swimming was significantly prolonged， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in total water intake between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the levels of CNP in the heart， kidney and serum of the stress group increased significantly （all P < 0.05）. Conclusion Chronic stress can significantly increase the levels of CNP in heart， kidney and serum， suggesting that the changes of CNP expression in peripheral tissues may be related to the occurrence and development of stress-induced depression.

[Key words] Depression; Chronic stress; Natriuretic peptide; C-type natriuretic peptide

抑郁癥的发病机制和防治策略研究始终是神经科学领域研究的热点。大量流行病学和动物实验研究[1-3]发现，应激，尤其慢性应激是抑郁症发生的重要因素。慢性应激在诱发抑郁症发生的同时，也对机体外周组织产生显著影响，是糖尿病、高血压、心肌梗死、肝硬化等应激相关疾病发生的重要诱因。值得注意的是，抑郁症和上述应激相关疾病的发生存在交互影响，应激诱发的外周组织释放功能分子变化，可进一步通过内分泌方式参与抑郁症发生发展。抑郁症常与冠心病、高血压等多种疾病合并发生[4]。同时，抗抑郁策略可通过调控外周组织器官功能变化缓解个体的抑郁行为。钠尿肽（natriuretic peptide，NPs）主要包括心房钠尿肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）、脑钠尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）、C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）、Dendroaspis型钠尿肽（dendroaspis natriuretic peptide，DNP）等。CNP广泛存在于中枢神经系统、血管、血液和外周组织[5]，具有显著的扩张血管、抗焦虑、调节细胞生长和内分泌等作用。目前，在应激致抑郁发生过程中，不同组织CNP的表达变化规律尚未见报道。本研究通过建立慢性轻度应激致抑郁小鼠模型，分别检测小鼠海马、心、肾、肝和血清中CNP水平的变化，探讨应激对不同组织CNP表达变化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取雄性7周龄ICR小鼠20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006，合格证号：11400700363290]。所有动物实验均经河北医科大学实验动物伦理委员会批准。小鼠饲养条件为室温（22±1）℃，湿度（50±10）%，采用12 h/12 h的昼夜周期（8：00关灯，20：00开灯），自由摄食饮水。

1.2 试剂

C型钠尿肽酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（货号：ml057895-C）购自上海酶联生物科技有限公司，所有操作按试剂盒说明书进行。

1.3 慢性轻度应激小鼠模型的建立

小鼠经适应饲养3 d后，采用随机随机数字表法将其分为对照组和应激组，每组10只。对照组小鼠正常饲养;应激组小鼠进行慢性应激处理，每天随机2种应激刺激，应激处理持续28 d。每天应激刺激采用充分考虑急性和慢性应激结合的原则，应激刺激方式主要包括：冰水游泳5 min、夹尾1 min、束缚2 h、禁食24 h、禁水24 h、潮湿24 h、倾斜24 h、空笼24 h、昼夜颠倒。28 d应激结束后进行抑郁行为的测定，评价造模是否成功[6]。

1.4 行为学测定

参考课题组前期研究[6-7]，选取糖水偏爱测试、悬尾测试和强迫游泳测试评价小鼠的抑郁样行为学。

1.4.1 糖水偏爱测试  整个测试分为适应和测试两个阶段。实验前48 h，训练小鼠适应含糖饮水，每笼放置2瓶1%蔗糖水。48 h后小鼠禁食水24 h处理。每只小鼠单笼放置，每笼给予事先准备好的2瓶水，其中1瓶为1%蔗糖水，1瓶为纯水，12 h时交换2个水瓶位置，24 h时计算喝水量。总摄水量=糖水消耗量+普通水消耗量;糖水偏爱值=糖水消耗量/总摄水量。

1.4.2 悬尾测试  将小鼠倒吊于距地面60 cm的横杆上6 min，小鼠的固定位点为距离尾稍1 cm处，观察记录前2 min内小鼠的不动潜伏期和后4 min小鼠总不动时间，不动状态定义为小鼠停止挣扎，躯体呈放松状态。

1.4.3 强迫游泳测试  将小鼠单独置于水深15 cm的玻璃缸内（高20 cm，直径14 cm），水温（22±1）℃，游泳6 min，观察记录前2 min内小鼠的不动潜伏期和后4 min内小鼠在水中总不动时间。漂浮状态时间定义为小鼠微蜷躯体，四肢尤其是后肢无大幅度摆动。

1.5 血清、组织样本制备与ELISA检测

行为学测试评价造模成功后，于末次测试结束后第2天，摘除眼球取血，室温静置1 h，2000 r/min离心10 min，离心半径7 cm，收集血清，备用。小鼠断头取脑，分离海马组织，取心、肝、肾组织，液氮快速冷冻后于-80℃冰箱冻存，备用。组织蛋白提取、定量操作按试剂盒说明书进行，ELISA检测操作按相关试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验;不符合正态分布的改用中位数或四分位数间距[M（QR）]表示，两组间比较采用Wilcoxon非参数检验（秩和检验）。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠抑郁样行为比较

应激组小鼠糖水偏爱值较对照组明显减小（P < 0.05），且两组糖水测试中总摄水量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;应激组小鼠悬尾测试的不动潜伏期、不动总时间较对照组均明显缩短，且不动总时间呈延长的趋势，差异有统计学意义（P < 0.05）;应激组强迫游泳测试的不动潜伏期较对照组明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05），但两组强迫游泳测试的不动总时间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 两组小鼠海马、心、肝、肾和血清CNP含量比较

经28 d慢性应激处理后，应激组小鼠心、肾和外周血中CNP水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05），且海马和肝中CNP水平呈下降趋势。见表2。

3 讨论

机体的应激效应具有广泛性和非特异性。除抑郁症外，长期慢性应激往往也是肝脏疾病、心脑血管疾病等的重要风险因素[1-3]。抑郁症与多种慢性疾病共患已经引起广泛关注。本研究采用ELSIA法检测CMS后小鼠海马、心、肾、肝等不同组织和血清中CNP水平的变化，结合行为学测试结果，表明抑郁小鼠心、肾、血清中CNP水平均明显升高，但其在海马和肝中均呈下降趋势。

经典的抑郁症病因学主要涉及遗传因素、神经递质失调、神经再生损伤和神经过度炎症等[8]。慢性应激在导致抑郁行为的同时，也会造成肝脏、心血管等外周组织结构和功能的损伤。同时，某些药物/策略可通过改善外周组织器官功能发挥显著的抗抑郁作用，提示在应对应激的过程中，机体中枢神经系統和外周组织存在交互作用，对外周组织的调节有可能成为抑郁症防治的重要方向[9-11]。随着对抑郁症研究的不断深入，外周组织可通过释放功能分子入血，并以内分泌方式随血液循环到特定靶器官发挥作用。运动可促进脂肪细胞分泌脂联素，直接通过血脑屏障促进海马神经发生，改善小鼠抑郁行为[12]，而外源性补充乳酸也可以产生显著的抗抑郁作用[13]，进一步提示外周组织可通过内分泌方式参与对抑郁行为的调节。

NPs家族成员众多，ANP、BNP与焦虑、抑郁、学习记忆和成瘾等中枢神经功能调控密切相关，而CNP的功能研究相对较少。ANP是垂体-肾上腺皮质激素释放的肽能拮抗剂，参与个体情绪调节[14]。He等[15]报道，大鼠中枢ANP给药能产生明显的抗焦虑作用。最新流行病学研究[16]发现，抑郁的发生可能与儿童期不良经历导致ANP水平下降有关。与ANP相似，Strohle等[17]发现BNP均具有明显的抗焦虑作用。最近的一项流行病学资料[18]显示，通过对529例轻度抑郁的患者运用焦虑、抑郁量表进行评分，线性回归模型揭示了N末端前脑钠肽（NT-proBNP）水平与焦虑、抑郁、疲惫等消极情感呈负相关，并推测NT-proBNP可能作为评估社会心理状况的一个重要预测因子。CNP作为钠尿肽家族的重要成员，其结构与ANP相似，功能却有显著差异。运动预适应可通过上调心肌CNP及其受体NPR-B的表达，发挥保护作用[19]，基因敲低CNP阻断NPRB/cGMP信号通路，从而加重大鼠心肌损伤并引起心室重构[20]。肾脏组织中CNP的表达受其受体NPR-B和NPR-C调控，且与肾病患者自主神经功能障碍相关[21]。CNP在非酒精性脂肪肝炎小鼠肝脏内皮细胞中的过表达，具有抗纤维化和抗炎作用[22]。以上研究提示，CNP可能作为一种保护性细胞因子拮抗外周器官损伤，cGMP信号通路可能参与其中。Decker等[23]发现，海马中CNP刺激cGMP通路后观察到的突触效应，可能是肽类激素对长时程增强的影响，提示CNP可影响神经细胞的可塑性，与学习记忆密切相关[24]。抑郁症可通过NPs/NPRs信号通路使胃肠道间质细胞减少[25]，CNP可与钠尿肽受体作用明显减少干细胞因子的表达，进而改善胃平滑肌细胞的功能，提示CNP在抑郁的发生发展中也可能发挥重要的作用。本研究采用慢性应激小鼠抑郁模型，首次发现慢性应激致抑郁小鼠心、肾和血清中CNP显著增加。外周组织增加的CNP是否参与抑郁的发生发展，是否可作为应激致抑郁症诊断标志物等，均值得进一步研究。

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（收稿日期：2019-01-18  本文編辑：王   蕾）