高效液相色谱法测定生附子中3种双酯型生物碱含量*

杨海宁，文瑾，孙筱林，王登才，张宇佳，郑稳生

(1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 100050；2.中国药学会学术部，北京 100022；3.三株医药生物研究所，济南 250100)

附子是毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，每年六月下旬至八月下旬采挖，主产于四川、湖南、湖北等地，始载于《神农本草经》。附子味辛、甘，性大热，有毒，具有补火助阳、散寒止痛、回阳救逆之功效，自古以来就是医家常用之品，但其毒性较强，临床用之不当可能导致中毒或死亡。《中华人民共和国药典》2015年版规定，附子常用量3～15 g[1-3]。但火神派代表吴佩蘅在方剂中动辄使用百余克附子，病情严重者可加至200～400 g[4]。附子中所含有效成分与有毒物质均为二萜类生物碱类，其毒性主要作用于神经系统、肌肉组织和心脏。其中双酯型生物碱毒性最强，主要包括乌头碱、次乌头碱和新乌头碱，此3种生物碱含量高，特征性强，常作为含附子制剂的测定指标[5-6]。目前文献中对生物碱类物质的提取多采用氨水碱化样品，再用有机试剂进行提取，但该方法操作较繁琐，重复性差。笔者在本研究采用酸水提取附子中双酯型生物碱，提取率更高，操作更简单，重复性好，建立的同时测定3种双酯型生物碱的高效液相色谱法灵敏度高、操作简单、重复性好，可以用于生附子中3种双酯型的含量测定，可为生附子质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 普析L600型高效液相色谱仪(北京普析通用公司)，检测器(北京普析通用公司，型号：L600-UV)；色谱柱WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；XS105DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.01 mg)；BSA423S-CW型电子天平(北京塞多利斯科学仪器有限公司，感量：0.001 g)；DTC-27型超声波清洗机(鼎泰生化科技设备制造有限公司)。

1.2试药 生附子(济南三株医院提供，批号：171225，180108，180302；产地四川，经济南三株医院牛纪江主任医师鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根)；乌头碱对照品(批号：17110910，含量98.01%)、次乌头碱对照品(批号：17111310，含量99.04%)、新乌头碱对照品(批号：MUST-17111010，含量98.12%)均由成都曼思特生物科技有限公司提供；乙腈(上海安谱实验科技股份有限公司，批号：G2781296，含量99.99%)、甲醇(赛默飞世尔科技有限公司，批号：175167，含量99.99%)、四氢呋喃(上海安谱实验科技股份有限公司，批号：V593K072，含量99.99%)、醋酸铵(北京伊诺凯科技有限公司，批号：KBCK706，含量97%)、盐酸(北京化工厂，批号：20150701，含量36%～38%)、其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Wondasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；以60 mmol·L-1醋酸铵作为流动相A，以乙腈-四氢呋喃(9：1)为流动相B，梯度洗脱(0～50 min，26%→38%B)，流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃； 波长235 nm；理论板数按乌头碱计算应≥3000，相邻两色谱峰分离度应>1.5。混合对照品、样品色谱图见图1。

2.2对照品的制备 精密称取各对照品适量，用0.05%盐酸甲醇溶解，配成新乌头碱、次乌头碱、乌头碱(分别为0.526，0.522，0.108 mg·mL-1)混合对照品储备液。取该储备液1 mL，加0.05%盐酸甲醇至10 mL，定容，滤过，取20 μL进样。

2.3供试品溶液的制备 取过筛孔内径0.15 mm(100目筛)生附子粉末1 g于具塞磨口锥形瓶中，精密加入1%盐酸10 mL，摇匀，超声处理30 min，放至室温，3000 r·min-1离心10 min(r=15.7 cm)，取上清液，滤过，取20 μL进样。

2.4线性关系考察 精密吸取“2.2”项对照品储备溶液1，4，8，10，12，20 μL，分别进样测定峰面积，以对照品进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。新乌头碱回归方程Y=1 063 519.314X-31 122.424(r= 0.999 7)。结果表明，在0.526～10.520 μg范围内，新乌头碱峰面积与进样量呈良好的线性关系；次乌头碱回归方程为Y=1 216 539.728X-34 643.270(r=0.999 5)。结果表明，在0.522～10.440 μg范围内，次乌头碱峰面积与进样量呈良好的线性关系；乌头碱回归方程为Y=1 190 920.635X-6 345.444(r=0.999 2)。结果表明，在0.108～2.160 μg范围内，乌头碱进样量与峰面积呈良好的线性关系。

A.混合对照品；B.生附子；1.新乌头碱；2.次乌头碱；3.乌头碱。

A.mixed reference substances； B.lateral roots ofAconitumcarmichaeliiDebx.；1.mesaconitine； 2.hypaconitine；3.aconitine.

Fig.1HPLCchromatogramsofmixedreferencesubstancesandlateralrootsofAconitumcarmichaeliiDebx.

2.5精密度考察 精密吸取混合对照品溶液20 μL，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图。结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积的RSD 值分别2.97%，1.14%，2.39%，表明该色谱方法精密度良好。

2.6加样回收率实验 精密称取已知含量的生附子药材粉末9份各1.000 g，分别精密加入新乌头碱、次乌头碱及乌头碱对照品溶液适量，使样品溶液中新乌头碱、次乌头碱及乌头碱含量为样品中相应物质含量的80%(3份)、100%(3份)、120%(3份)。照“2.3”项供试品溶液制备方法制备，照“2.1”项色谱条件测定3种双酯型生物碱含量，分别计算加样回收率及RSD值，结果见表1。

2.7稳定性实验 精密吸取同一样品，分别于0，2，4，8，10，24 h 注入高效液相色谱仪，检测相应双酯型生物碱的峰面积，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积RSD值分别为2.95%，3.01%，2.08%。结果表明采用酸水提取的供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表1 3种双酯型生物碱加样回收率实验结果

2.8重复性实验 分别精密称定同一批生附子粉末6份，每份1 g，照“2.3”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录各色谱峰面积。测得新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的峰面积RSD值分别为2.3%，1.1%，1.3%，结果表明本方法测定3种双酯型生物碱含量重复性良好。

2.9样品含量测定 取生附子3批，按“2.3”项方法制备供试品，按照“2.1”项色谱条件进行测定，结果见表2。

3 讨论

3.1提取方法考察 附子中生物碱除极少部分以游离状态存在外，大部分以生物碱盐的形式存在于植物细胞。《中华人民共和国药典》2015年版采用氨水碱化样品，将生物碱游离出来，再提取。但实际操作中笔者发现，采用该方法提取双酯型生物碱，含量明显低于酸水直接提取。笔者在本实验中还考察了不同有机溶剂对结果的影响，结果显示，采用三氯甲烷提取时三氯甲烷易挥发，实验操作困难，结果可重复性差；采用异丙醇：乙酸乙酯(1：1)提取重复性较好，但操作繁琐，提取率偏低，约为1%酸水提取率的75%。同时，笔者在本实验中还考察了酸用量对实验结果的影响，结果表明，在1%盐酸溶液中，乌头碱稳定性优于0.5%盐酸。因此，笔者选择1%酸水作为最终提取液。

表2 样品含量测定结果

Tab.2Resultsofcontentdeterminationonsamplesμg·g-1

样品平均含量新乌头碱次乌头碱乌头碱171225689.2698.2139.7180108622.9657.9128.2180302402.7457.278.1

3.2液相色谱条件的选择 本实验中，笔者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氢呋喃-水等系统作为流动相的色谱情况。由于3种双酯型生物碱最佳检测波长约235 nm，采用甲醇-水系统时基线波动较大，不利于检测，而采用乙腈-水系统时可以有效避免基线波动，但乌头碱类生物碱属于含氮化合物，具有弱碱性，单纯使用乙腈-水系统会有拖尾峰出现，因此选择在水相中加入醋酸铵来改善峰型[7]。笔者在实验中发现，加入10 mmol·L-1醋酸铵时，仅对低浓度乌头碱峰形有改善作用，而随着乌头碱浓度增加，依然有拖尾，所以最终色谱条件选择60 mmol·L-1醋酸铵溶液作为水相。虽然乙腈-水-醋酸铵系统基线平稳，峰型较好，但3种双酯型生物碱分离度较差，调节流动相比例依然不能将其完全分离，而采用乙腈与四氢呋喃9：1混合作为有机相时，3种双酯型生物碱分离度良好。

3.3附子的毒性及减毒 附子毒性主要来源于双酯型生物碱，且该类化合物对Na+通道的II位点具有高亲和力，其可增加Na+内流，进而引起心律失常，导致严重急性毒性(LD50约0.15 mg·kg-1)[8]。双酯型生物碱稳定性差，经炮制和煎煮可水解成苯甲酰类单酯型生物碱及原碱，且随煎煮时间的变化，其含量呈现一定规律变化。生成的单酯类生物碱活性较强且毒性显著降低[9-11]。因此，现在临床煎剂及中成药中一般选用制附子。附子的传统炮制解毒方式较多，包括去皮、炮、炒、煨、烧、黑豆制、蜜制、姜制等[12]。在此基础上，有学者利用先进的科学技术，摸索出附子炮制新工艺，如邓文伟等[13]采用烘箱烘烤法成功制备出质量合格的制附子，杨明等[14]采用微波炮制出药效好、毒性低的附子。附子与其他中药配伍也能在一定程度上减轻其毒性，例如与甘草配伍，甘草中羧酸可与附子中生物碱发生缔合作用生成沉淀，进而降低附子之毒[15]。

综上所述，笔者在本实验建立的液相检测方法能同时测定生附子中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量，且该方法简单、灵敏，可用于附子中双酯型生物碱的质量控制。