柑橘中苦味物质对HeLa细胞增殖与凋亡的作用机制

毕静莹，李 华*，王 华*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏职业技术学院生物与制药技术系，宁夏 银川 750021）

柑橘属（Citrus L.）为无患子目芸香科类植物，是橘、柑、橙、金柑、枳、柚等的总称。柑橘及其制品中的苦味早已为人们所熟知，其苦味主要由两类具有抑癌活性的物质提供，一类是以柠檬苦素和诺米林为代表的高度氧化的四环三萜类次生代谢产物柠檬苦素类似物；另一类是以柚皮苷为代表的黄酮类物质[1-4]。柠檬苦素类似物主要通过清除自由基[5]、激发谷胱甘肽转移酶活性[6]、抑制致癌化学物质活性[7-9]、抑制肿瘤细胞增殖[10]等途径防治肿瘤，能明显抑制神经瘤[5]、肝癌[11-13]、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌[14]、肺癌及胃癌等的发生，尤其能够诱导白血病细胞株（HL60）中凋亡蛋白酶依赖的细胞死亡[15]；柚皮苷通过在癌细胞的DNA链形成时阻止癌细胞DNA链的合成、在癌细胞DNA链延长时剪切或缩短DNA链，从而抑制肿瘤细胞的增殖；对人淋巴细胞白血病、肝癌[16]、乳腺癌[17]、胰腺癌、胃癌、结肠癌[18]等多种癌细胞增殖具有显著的抑制作用。

宫颈癌是发展中国家发生率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤疾病，占总癌症发生率的11%，每年宫颈癌新病例超50万，而85%发生在发展中国家[19]。正常生理活动下细胞增殖与凋亡处于动态平衡中，而恶性肿瘤是机体细胞过度增殖而引起的疾病，其严重程度取决于癌细胞发生部位、恶化程度及是否转移，因此研究癌细胞增殖、凋亡和迁移是治疗癌症的关键。

鉴于柚类种子和白色海绵层中柠檬苦素类似物[20]和柚皮苷[21]含量较高，故本研究选择‘高台’蜜柚这两部分进行柠檬苦素、诺米林和柚皮苷3 种苦味物质的提取、纯化和超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）检测。通过预实验并结合文献[22-23]报道，发现3 种苦味物质在50 μmol/L时对癌细胞均有显著的抑制作用，因此本研究均选用50 μmol/L浓度的这3 种苦味物质对宫颈癌HeLa细胞进行处理，利用细胞增殖检测（cell counting kit-8，CCK-8）、细胞划痕和逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）实验研究3 种苦味物质对HeLa细胞增殖、迁移和凋亡的影响，以验证其作用效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜完熟的‘高台’蜜柚，2017年12月中下旬采于四川渠县，取其种子和白色海绵层（切成1 cm左右的薄片），于50 ℃烘干，恒质量后粉碎机处理，分别过60、40 目筛备用。

HeLa细胞株由西北农林科技大学动物科技学院实验室培养并保存。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 浙江天杭生物科技股份有限公司；青链霉素溶液、杜氏培养液（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）/高糖（high-glucose，HG）培养基、胰蛋白酶溶液 美国Hyclone公司；柠檬苦素、诺米林和柚皮苷（均为色谱纯）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma公司；SYBR Green qPCR Master Mix、PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒 TaKaRa生物技术（北京）有限公司；RNase-Free ddH2O 生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8试剂盒 诺唯赞生物科技有限公司；TRIzol试剂 天根生化科技有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇（均为分析纯） 四川西陇化工有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Vortex-Genie 2多功能漩涡混合器 美国Scientific Industries公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度计安捷伦科技有限公司；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；ICX41倒置荧光显微镜 舜宇光学科技（集团）有限公司；MicroCL 21R离心机 美国Thermo Scientific公司；IQ5实时荧光定量PCR仪 美国伯乐公司；LightCycler®480实时荧光定量PCR仪 瑞士罗氏公司；UPLC I-Class UPLC（配有二极管阵列检测器、Empower色谱工作站、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 苦味物质的提取、纯化

1.3.1.1 柠檬苦素和诺米林的提取和纯化

柠檬苦素和诺米林的提取参照孟鹏等[24]的方法，并进行改进。取柚子种子粉末10.0 g，于索氏提取器中用石油醚（沸程60～90 ℃）60 ℃水浴回流脱脂至无色，过滤。按照料液比1∶20加入三氯甲烷，超声波250 W辅助提取45 min，过滤后10 000 r/min、10 ℃离心10 min，上清液40 ℃旋转蒸发至干，加色谱甲醇定容至10 mL，0.22 μm滤膜过滤后按照孟鹏[25]的方法进行柠檬苦素和诺米林的重结晶纯化。

1.3.1.2 柚皮苷的提取和纯化

柚皮苷的提取参照周石磊等[26]的方法，并进行改进。取白色海绵层粉末10.0 g置于锥形瓶中，以料液比1∶25（m/V）加入体积分数70%的乙醇溶液，250 W超声波60 ℃辅助提取60 min，提取液过滤后10 000 r/min、10 ℃离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后按照贾冬英[27]的方法进行柚皮苷的重结晶纯化。

1.3.1.3 提取率和纯度的计算

提取率和纯度分别按式（1）、（2）计算。

1.3.2 苦味物质的UPLC分析

UPLC条件参考NY/T 2011—2011《柑橘类水果及制品中柠碱含量的测定》、NY/T 2014—2011《柑橘类水果及制品中橙皮苷、柚皮苷含量的测定》和孟鹏等[24]的方法进行检测分析，并进行改进。柠檬苦素和诺米林：流动相为乙腈-水（体积比为45∶55），等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，检测波长215 nm，进样量1.0 μL；柚皮苷：流动相为甲醇-水（体积比为40∶60），检测波长283 nm，其他条件同柠檬苦素和诺米林。

1.3.3 HeLa细胞培养及苦味物质对其增殖的影响

1.3.3.1 HeLa细胞培养

细胞复苏：HeLa细胞株液氮取出后，在37 ℃恒温水浴锅中快速解冻，轻轻摇晃冻存管使其在1 min内融化，体积分数为75%的乙醇溶液擦拭冻存管后移至无菌操作台，冻存管内细胞悬液转移至2 mL离心管，1 500 r/min室温下离心2 min，弃培养基，用1 mL含体积分数10% FBS的培养基重悬细胞后转移至100 mm培养皿中，加入适量体积分数10% FBS、1%双抗培养基高糖培养基中，上下摇晃使细胞均匀分布后放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

细胞传代：在倒置荧光显微镜下观察细胞汇合度达到90%时，细胞需要进行传代。细胞弃原培养基，并用PBS洗涤细胞2～3 次后加入体积分数0.25%胰蛋白酶溶液，37 ℃消化至显微镜下细胞变圆后用枪头反复吸打培养皿底部至细胞悬浮，立即加入含血清培养基终止消化，并将细胞悬浮液转移至2 mL离心管中，1 500 r/min室温下离心2 min，弃上清液，用完全培养基洗涤细胞一次后重悬细胞并接种至3 个同尺寸培养皿中。

细胞冻存：细胞培养至对数期时弃培养基，加入体积分数为0.25%胰蛋白酶溶液消化并用离心管收集细胞，并用冻存培养基（V（DMSO）∶V（FBS）∶V（DMEM/HG）＝1∶2∶7）重悬细胞至细胞浓度为1×106～5×106个/mL后移入冻存管中，封口后标注细胞名称和日期，用冻存盒冻存。

1.3.3.2 CCK-8试剂盒检测3 种苦味物质对HeLa细胞增殖的影响

HeLa细胞培养至对数期时，弃培养基，PBS洗涤细胞两次，用体积分数0.25%胰蛋白酶溶液将HeLa细胞从培养皿上消化下来，用含体积分数为10% FBS、1%双抗高糖培养基配成细胞密度为5×105个/mL的单细胞悬液，在96 孔板中，每孔加入100 μL单细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后分别加入柚皮苷、柠檬苦素和诺米林，使得3 种物质终浓度为50 μmol/L，每个组设置5 个复孔。处理0 h和24 h后，弃培养基，PBS洗涤两次，每孔加入5 μL CCK-8和95 μL含10% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，用酶标仪在450 nm波长条件下测定OD值。对照组不添加苦味物质，空白组不添加单细胞悬液，细胞抑制率按公式（3）进行计算。

1.3.3.3 RT-PCR检测3 种苦味物质对HeLa细胞凋亡的影响

根据NCBI数据库人基因序列，采用Primer 5.0软件和NEB Tm Calculator软件设计RT-PCR扩增引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 RT-PCR扩增引物信息Table 1 Primer information of quantitative RT-PCR amplification

3 种苦味物质处理细胞24 h后，回收细胞，利用柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒进行RNA的提取，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行cDNA反转录。采用表1所设计的引物，使用对经3 种苦味物质处理后的HeLa细胞的Fas、Caspase-9、Caspase-8等基因的相对表达量进行RT-PCR检测。RT-PCR反应体系如下：SYBR Green qPCR Master Mix 7.5 μL、Primer-F 1 μL、Primer-R 1 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 3.5 μL。RT-PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。

1.3.3.4 细胞划痕检测3 种苦味物质对HeLa细胞迁移的影响

取对数期生长的HeLa细胞，弃上清液，加PBS洗涤细胞两次后使用体积分数0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，用含体积分数为10% FBS的DMEM/HG培养基配成细胞密度为5×105个/mL的单细胞悬液，6 孔板每孔加入3 mL单细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待汇合度达到80%时，用枪头在皿中划“#”，弃培养基，用PBS洗涤3 次后分别加入50 μmol/L柚皮苷、柠檬苦素和诺米林的无血清培养基。并设置空白组（DMSO+无血清培养基），处理0、24 h和48 h后于显微镜下拍照，每组设5 个重复。

细胞迁移图片数据处理采用Image J软件，相对迁移率按照公式（4）进行计算。

式中：S0、St分别表示0、t/h时的划痕面积/m2。

1.4 数据处理与分析

基因相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算，差异显著性分析采用SPSS软件的独立样本t检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 苦味物质的检测

表2为3 种苦味物质的线性范围及回归方程。由标准曲线方程可知，柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的线性关系决定系数范围在0.996 4～0.999 7，说明在质量浓度范围内线性关系良好。本实验柠檬苦素类似物的提取率为5.21 mg/g。柠檬苦素和诺米林的纯度分别为94.08%和93.91%；柚皮苷的提取率为7.72 mg/g，纯度为93.39%。

表2 柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的线性范围及回归方程Table 2 Linear ranges and regression equations for calibration curves of limonin, nomilin and naringin

2.2 3 种苦味物质抑癌活性研究

2.2.1 3 种苦味物质对HeLa细胞增殖的影响

50 μmol/L的柚皮苷和诺米林处理HeLa细胞24 h后能明显抑制HeLa细胞增殖，细胞抑制率分别为（8.05±1.25）%和（4.16±1.35）%；同时，可观察到处理组培养液中均出现漂浮的死细胞。而柠檬苦素对HeLa细胞抑制率较小，仅为（2.13±0.84）%。

2.2.2 3 种苦味物质对HeLa细胞凋亡的影响

由图1可知，经过柠檬苦素处理HeLa细胞24 h后，与对照组相比，Bax基因表达量极显著增加（P＜0.01），Bcl-2基因表达量显著增加（P＜0.05）；HeLa细胞经过柚皮苷处理24 h后Bax基因表达量较对照组极显著增加（P＜0.01）；HeLa细胞经过柚皮苷、柠檬苦素和诺米林处理24 h后TNFR1基因表达量较对照组有明显的增长趋势，而Casepase-8基因表达量较对照组无明显变化。此外，经这3 种物质处理HeLa细胞24 h后，Caspase-9、Caspase-3、Fas、Cytochrome c基因表达量与对照组相比均无显著变化（此部分数据和图未呈现）。

图1 3 种苦味物质对HeLa细胞Bax（A）、Bcl-2（B）、TNFR1（C）、Caspase-8（D）基因相对表达量的影响Fig. 1 Effects of three bitter substances on relative expression levels of Bax (A), Bcl-2 (B), TNFR1 (C) and Caspase-8 (D) in HeLa cells

2.2.3 3 种苦味物质对HeLa细胞迁移的影响

图2 3 种苦味物质对HeLa细胞迁移的抑制Fig. 2 Three bitter substances inhibited HeLa cells migration

图3 3 种苦味物质对HeLa细胞相对迁移率的影响Fig. 3 Effects of the three bitter substances on relative mobility of HeLa cells

图2 、3细胞划痕实验结果显示了3 种苦味物质对HeLa细胞迁移的抑制和相对迁移率的影响。诺米林处理HeLa细胞24 h和48 h后，HeLa细胞相对迁移率极显著降低（P＜0.01），表明诺米林显著降低了HeLa细胞的迁移能力（图2中50 μmol/L诺米林处理24、48 h和图3C）。柠檬苦素处理HeLa细胞24 h后，对照组迁移距离较实验组远（图2中50 μmol/L柠檬苦素处理24 h），HeLa细胞相对迁移率极显著降低（P＜0.01），但48 h后HeLa细胞迁移能力较对照组没有显著差异（图3A），可能是培养基中有血清导致结果受到增殖的影响。柚皮苷处理HeLa细胞24 h和48 h后，HeLa细胞相对迁移率极显著降低（P＜0.01）（图2中50 μmol/L柚皮苷处理24、48 h和图3B），因此，柚皮苷显著降低了HeLa细胞的迁移能力。

3 讨 论

本研究以高台蜜柚种子和白色海绵层为原料，分别进行柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的提取、分离纯化和检测。柠檬苦素类似物和柚皮苷的提取率分别为5.21 mg/g和7.72 mg/g，柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的纯度分别为94.08%、93.91%和93.39%。

柠檬苦素、诺米林和柚皮苷均选择50 μmol/L工作浓度，通过体外培养HeLa细胞，研究其对HeLa细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响，以不同方式探讨3 种苦味物质对HeLa细胞的作用机制：柚皮苷和柠檬苦素均能显著促进HeLa细胞凋亡，柚皮苷和诺米林均能抑制HeLa细胞增殖，3 种苦味物质均能显著抑制HeLa细胞迁移。

近几年的研究发现，柑橘及其制品中的苦味物质对不同癌细胞的增殖均有显著抑制作用。宋淑慧等发现40 μmol/L柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3细胞株增殖，猜测是通过下调COX-2 mRNA及其蛋白表达而达到抗肿瘤作用[22]。胡昕等除了发现40 μmol/L柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞株增殖的显著抑制作用外，还发现其促使P38 MARK和ERK1/2蛋白表达下调[23]。邹连生发现柠檬苦素类似物显著抑制人肝癌和膀胱癌细胞株的增殖，诺米林的抑制率优于柠檬苦素，且呈时间-剂量依赖效应，同时对正常体细胞无毒害作用[28]。唐莉莉等发现30 mg/mL柠檬苦素能通过影响MCF-7细胞周期抑制乳腺癌细胞增殖[29]。张娟娟等发现2.5 μg/mL柠檬苦素能有效抑制人肝癌细胞株的增殖[12]。大量研究证明3 种苦味物质对癌细胞增殖有抑制作用，本研究通过CCK-8实验证明了3 种苦味物质对宫颈癌细胞增殖的影响，柚皮苷和诺米林作用24 h后能明显抑制HeLa细胞增殖，而柠檬苦素抑制作用较弱，不同的柠檬苦素类似物对同一癌细胞的作用效果是有较大差异的。1989年Lam等证明了诺米林在肝脏和小肠黏膜通过诱导谷胱甘肽转移酶活性从而抑制致癌物质诱导肿瘤发生的效果明显，而柠檬苦素的作用较弱[11]。但是Miller等发现柠檬苦素对口腔癌和皮肤癌的抑制效果却显著高于诺米林，目前较为认可的解释是呋喃环在其中发挥作用，但是其具体作用机理还有待进一步研究[7]。

目前，还有部分学者从促凋亡方向对3 种苦味物质的抑癌效果进行研究。张春艳发现柚皮苷能通过抑制增殖和促进细胞凋亡达到抗肿瘤效应，C4’—OCH3基团在抑制HepG-2细胞增殖中发挥了重要作用[30]。Yeh等发现柚皮苷能有效抑制致癌物质对遗传物质的破坏作用[31]。柚皮苷通过减少肿瘤坏死因子的释放，抑制细胞壁中的脂多糖释放从而毒害正常细胞，从而能减少致癌物质对正常体细胞破坏，维持细胞内遗传基因稳定[32]。为探究3 种苦味物质抑制癌症的作用机制，本研究利用实时定量PCR实验，对Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、TNFR1、Fas、Cytochrome c基因表达量进行了检测。柠檬苦素作用于HeLa细胞24 h后基因Bcl-2、Bax表达量极显著增加（P＜0.01），柚皮苷作用于HeLa细胞后基因Bcl-2表达量极显著增加（P＜0.01），证明柚皮苷有可能通过内源性途径抑制细胞凋亡。同时，死亡受体基因TNFR1表达量有明显上升趋势，可能是其外源性凋亡途径也发挥了作用；Caspase-8表达量无明显变化，因此TNFR1不是通过激活Caspase-8而调控外源性凋亡途径的，而有可能通过激活TNK/AP-1途径达到外源促凋亡作用。在研究过程中发现经过3 种苦味物质处理后，HeLa细胞的迁移速率可能变慢，为了证明猜测，进行了细胞划痕实验。细胞迁移实验结果证实3 种苦味物质均能极显著抑制癌细胞转移。癌细胞扩散是癌症治疗过程中一大难题，其会导致病征的严重，因此如何控制癌细胞扩散和减缓细胞迁移速率至关重要。本研究中还发现苦味物质作用后癌细胞贴壁较弱，形态发生较大变化，活性降低，这也是细胞迁移能力显著减弱的具体体现。

通过本研究发现，柑橘及其制品中3 种苦味物质柠檬苦素、诺米林和柚皮苷对宫颈癌HeLa细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，能够作为一种潜在的抑制癌症的药物原材料进行开发和研究，实验结果可为今后的相关探索提供一定的数据支持。