附子理中汤对变应性鼻炎大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响*

柴宇琪 滕磊 忻耀杰

变应性鼻炎是机体在接触变应原后主要由免疫球蛋白IgE介导的Ⅰ型变态反应。在此过程中，多种炎性细胞及细胞因子起到关键作用，且骨髓中细胞因子是募集、趋化和激活引起变应性鼻炎的炎性细胞的主要来源[1]。而间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能和免疫调控的作用[2]，被认为可调节细胞因子的水平进而影响变应性鼻炎炎性细胞的表达[3]。本实验构建变应性鼻炎的大鼠模型，并给予附子理中汤治疗，观察治疗前后以及与对照组比较，变应性鼻炎大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响。

资料与方法

1 实验动物

6周龄清洁级SD大鼠36只，雌雄各半，体重均位于160～230g之间，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。自由进水、常规饲料喂养，室温稳定于20～25℃,空气湿度为60%。

2 实验试剂和设备

卵清蛋白（Ⅴ级Sigma，美国）；氢氧化铝、PBS磷酸盐缓冲液、抗体稀释液(科夷生物科技有限公司提供)；CD29（ab179471）单克隆抗体和APC-Goat Anti-Rabbit（Ab130805）（Abcam，美国）；CD44-PE（88151） 单克隆抗体 （CST，美国）；CD45-FITC（561867）单克隆抗体（BD，美国）；Fresco离心机（Thermo，美国）；FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）；Scepter细胞计数器（Millipore，美国）。

3 实验分组

将36只SD大鼠按雌雄分别随机分成两组，每组雌雄各半，各组18只。A组为变应性鼻炎模型组；B组为变应性鼻炎模型+附子理中汤方组。B组于模型建立次日开始连续7天用按成人剂量折算用药量的附子理中汤2ml灌胃；A组不做灌胃处理。

4 模型复制

①系统致敏阶段：以20mg卵清蛋白加入30mg氢氧化铝为免疫佐剂，溶于1ml 0.9%氯化钠注射液中，腹腔注射，隔日1次，共8次。②鼻腔激发阶段：在完成系统致敏后，每日以50mg卵清蛋白溶于1ml 0.9%氯化钠注射液中，制成浓度为5%的溶液，滴鼻激发变态反应，每只大鼠每侧鼻腔50μL滴鼻，连续10日。③局部维持阶段：每次治疗前鼻腔继续用卵清蛋白激发，以维持变应性鼻炎的发作状态。5检测方法

变应性鼻炎模型建立当天为0天，在1、3、7天，B组灌胃治疗后2小时，给A、B两组取材，每次每组6只大鼠，雌雄各半。大鼠拉颈处死后，取完整右侧股骨，洗涤后冲洗骨髓腔，经洗涤离心稀释后，调节细胞浓度后收集100ul做检测，分别加入CD44-PE、CD45-FITC、CD29一抗震荡，PBS洗涤重悬后加入APC-Goat Anti-Rabbit二抗孵育，PBS洗涤后上流式细胞仪检测。将检测到的表面标志物CD29/CD44阳性/CD45阴性的细胞定为BMSCs。

6 统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件，计量资料采用t检验，检验水准为P=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 鼻部症状评分

比较1、3、7天取材的大鼠的鼻部症状，包括喷嚏、抓鼻、喘息、鼻分泌物4项，轻重程度分别为0-1-2-3分。A组和B组在各时间节点的鼻部症状评分见表1。结果显示，A组在第1、3、7天的积分比较无明显差异性（P＞0.05）。B组在第3天时积分已减少，在第7天时积分进一步减少，与第1天比较均有差异性（P＜0.05）。两组间比较，第1天时积分比较无明显差异性（P＞0.05）。第3天、第7天的积分比较均有差异性（P＜0.05）。说明B组（附子理中汤）能有效、持续地改善变应性鼻炎大鼠的症状。

表1 A、B两组在 1、3、7 天的鼻部症状评分表（±s）（n=6）

表1 A、B两组在 1、3、7 天的鼻部症状评分表（±s）（n=6）

*：同一时间节点与A组比较P＜0.05；△：与第1天比较P＜0.05。

第1天 第3天 第7天A组 6.5 0±1.3 7 7.3 3±1.7 5 6.8 3±2.0 4 B 组 6.8 3±0.7 5 5.1 7±0.7 5*△ 3.5 0±0.8 4*△

2 BMSCs检测结果

比较1、3、7天取材的大鼠的BMSCs，将检测到的表面标志物CD29/CD44阳性/CD45阴性的细胞占比取对数（lg）比较。A组和B组在各时间节点的BMSCs对数值见表2。结果显示，A组的BMSCs在第 1、3、7天的比较无明显差异性（P＞0.05）。B 组的BMSCs在第3天、第7天时均与第1天比较均有差异性（P＜0.05）。两组间比较，第 1、3、7 天时的 BMSCs比较均有差异性（P＜0.05）。说明B组（附子理中汤）能有效促进BMSCs的增殖，在第3天时BMSCs的增殖明显，第7天时仍维持在较高水平。

表2 A、B两组在 1、3、7 天的 BMSCs比较（±s）（n=6）

表2 A、B两组在 1、3、7 天的 BMSCs比较（±s）（n=6）

*：同一时间节点与A组比较P＜0.05；△：与第1天比较P＜0.05。

第1天 第3天 第7天A组 4.9 1±0.0 2 4.9 3±0.0 2 4.8 1±0.1 5 B组 4.9 4±0.0 2* 5.0 1±0.0 3*△ 5.0 1±0.0 2*△

讨论

变应性鼻炎的根本原因是脏腑虚损，正气不足，与肺、脾、肾三脏的功能关系最为密切。病位虽在肺，但病源在脾，病根在肾[4]。如玉屏风散治疗变应性鼻炎的广泛应用，不仅可改善症状，还可以增强机体免疫功能，调节免疫失衡[5]。但治疗上总是以益气温阳为主[6]。因此，具有温阳祛寒，益气健脾的附子理中汤临床常用于变应性鼻炎的治疗。本实验也表明了附子理中汤确实可以有效持续地缓解变应性鼻炎大鼠的局部症状。研究证实附子理中汤可以提升细胞免疫功能，改善体液免疫[7]。而调节Th1/Th2免疫平衡恰恰对治疗变应性炎症具有重要作用，也是治疗方面重要的切入点。

近年来的研究表明多种来源的MSCs均可纠正Th1/Th2免疫失衡[8，9]，显示出强有力的免疫调节能力，主要体现在其可分泌大量的可溶性细胞因子，如巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺素E2(PGE2)、白血病抑制因子(LIF)等，这些细胞因子可直接接触细胞，介导其免疫调节活性，或通过抗原递呈细胞参与介导免疫调节，或直接诱导T细胞凋亡，还可通过信号通路介导形成综合网络调控作用。其中主要的作用途径是通过显著抑制淋巴细胞增殖，升高调节性T细胞(Treg)比例而发挥作用[10，11]。正常人群中Treg能够有效地抑制Th2反应，而过敏人群常伴有Treg功能受损会导致Th2的异常激活，出现免疫失衡。MSCs可促进Treg细胞增殖，纠正Th1/Th2免疫失衡，且诱导产生的Treg细胞在MSC定植消失后可继续控制过敏炎症。

正是基于MSCs的免疫调节作用，MSCs正逐渐成为治疗变应性鼻炎的一颗新星。BMSCs来源于骨髓，具有自我复制、多向分化和低免疫原性及免疫调节功能，不仅可以分化替代损伤细胞，还可通过分泌和表达一系列免疫抑制因子，促进组织原位前体细胞增殖分化，介导组织修复再生。虽然基础研究仍处于细胞和动物模型试验阶段。但研究BMSCs的增殖及中药干预作用无疑具有广阔的临床应用前景。

基于以上认识，有学者提出假说，补气温阳等扶正治法可以修复患者的MSCs，进一步调节其免疫细胞的功能，以提高对抑炎因子的释放，达到促炎/抑炎的免疫平衡状态，并且也通过临床实践观察到比较好的疗效[12]。本次实验采用流式细胞检测技术，观察附子理中汤对变应性鼻炎大鼠BMSCs增殖的影响，在治疗第1天时，B组（附子理中汤）的BMSCs数量即和A组（空白组）比较有差异，到第3天时，两组的差异进一步扩大，结果差异有显著的统计学意义（P＜0.01），并一直维持到治疗结束。提示附子理中汤的干预对BMSCs的增殖有积极的影响。而治疗初期B组虽然显示出对BMSCs的增殖作用，但整体强度不高，一方面考虑是治疗刚刚开始，血药浓度不高，另一方面大鼠自身的BMSCs可能对早期实验结果有一定影响。而在治疗中后期的显著性差异，可能是由于大鼠自身BMSCs消耗后，附子理中汤促进并维持BMSCs的增殖的体现。但附子理中汤对BMSCs的增殖是如何介导变应性鼻炎鼻腔黏膜组织的屏障修复和功能恢复的，还需要深入的基础研究。