辛烯基琥珀酸纳米淀粉酯颗粒的制备及其食品级Pickering 乳液的特性

王 然

（1.长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林 长春 130033；2.吉林大学生物与农业工程学院，吉林 长春 130022）

Pickering乳液是采用纳米级或微米级的固体颗粒替代传统乳化剂，这些颗粒能吸附在油水界面上，并在油滴之间形成一道物理屏障，抑制油滴聚结，进而形成相对稳定的分散体系[1-2]。近十年，Pickering乳液的研究已经从应用无机颗粒（例如二氧化硅粒子、碳酸钙粒子和二氧化钛粒子等）发展到应用有机颗粒，有机颗粒包括碳水化合物类颗粒、脂类颗粒、蛋白质类颗粒等，其中食品级颗粒稳定的Pickering乳液成为近年的研究热点。Tan Ying等[3]研究采用乙酸酐和邻苯二甲酸酐相继与淀粉分子发生酯化反应，使淀粉纳米颗粒能够稳定水包油或油包水2 种类型的乳液；Liu Fu等[4]研究利用大豆蛋白纳米聚集体制备水包油型乳液，其中乳液中油滴的直径超过35 μm；Dokić等[5]研究利用辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）与蜡质淀粉发生酯化反应，再将制成的酯化淀粉代替乳化剂应用于制备水包油型乳液。Matos等[6]研究利用藜麦淀粉球制备水包油包水型多相Pickering乳液。

目前应用于Pickering乳液的食品级颗粒，在制备过程中，往往需要利用化学试剂对其进行改性处理，这难免存在化学试剂残留的问题，因此无法直接应用于食品加工中。然而，淀粉颗粒由于其良好的适应性和无毒性而广泛应用于Pickering乳液的制备[7]，同时，OSA淀粉酯为GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》明确规定可以作为乳化剂应用于食品工业。本研究采用OSA与玉米淀粉纳米颗粒发生酯化反应，制成具有亲油性的纳米淀粉酯颗粒，在制备过程中所有参与反应的试剂均为食品工业生产允许使用的试剂，制成的颗粒可以直接应用于食品级Pickering乳液的制备；为增进Pickering乳液的稳定性，本实验探讨Pickering乳液的制备条件，分析体系颗粒浓度、pH值、离子强度等条件对乳液稳定性的影响，为开发食品级Pickering乳液提供一种安全、有效的固体颗粒和简易、可行的制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉（包含淀粉99.5%、蛋白质0.3%、脂肪0.1%、灰分0.1%和水分4.8%） 长春大成实业集团有限公司；OSA、罗丹明B 美国西格玛奥德里奇贸易有限公司；玉米油 九三粮油工业集团有限公司；去离子水杭州娃哈哈集团有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Zetasizer Nano ZS90激光纳米粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；HN-1000Y超声波细胞破碎仪 上海汗诺仪器有限公司；IRAffinity-1傅里叶变换红外光谱仪岛津企业管理（中国）有限公司；IX81倒置荧光显微镜奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米淀粉纳米颗粒的制备

参考Dong Yan等[8]的方法稍作修改。将玉米淀粉与去离子水配制成1∶50（g/mL）的悬浮液，然后将悬浮液置于100 ℃恒温水浴中，以60 r/min搅拌1 h，停止加热并持续搅拌，在室温条件下冷却至25 ℃，得到淀粉胶状液。将淀粉胶状液以1∶200（V/V）的比例滴加至无水乙醇中，并以200 r/min的速率持续搅拌，滴加完成后，将上述液体置于离心机中，3 500 r/min离心5 min，倒掉上清液，将沉淀物用无水乙醇洗2 遍，然后于-70 ℃冻干，即得到玉米淀粉纳米颗粒。

1.3.2 辛烯基琥珀酸纳米淀粉酯颗粒的制备

参考Bhosale等[9]的方法并适当修改。将玉米淀粉纳米颗粒与体积分数85%的乙醇溶液配制成1∶5（g/mL）的悬浮液。用质量分数为3%的NaOH溶液将悬浮液的pH值调至8.5±0.5，然后分5 次滴加质量浓度为3 g/100 mL的OSA并在30 ℃下持续搅拌（100 r/min）6 h，在此过程中，保持体系pH值处于8.5±0.5范围内。用体积分数3%的HCl溶液将上述悬浮液的pH值调制至6.5±0.5，3 500 r/min离心5 min，去上清液，将沉淀物用去离子水洗2 遍，再用体积分数70%的乙醇溶液洗2 遍，最后于-70 ℃冻干，即得到辛烯基琥珀酸纳米淀粉酯颗粒（简称纳米淀粉酯）。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱的测定

利用傅里叶变换红外光谱对纳米淀粉酯化学结构的改变进行鉴定。将纳米淀粉酯粉末在真空条件下干燥至恒质量，然后将纳米淀粉酯粉末与KBr（光谱纯）以1∶75（m/m）的比例混合并压制成片状，使用红外光谱仪在波长4 000～400 cm-1范围内进行光谱扫描，设置光谱分辨率4 cm-1，经32 次扫描获得样品谱图。

1.3.4 纳米淀粉酯粒度分布的测定

将纳米淀粉酯与去离子水配制成3∶1 000（g/mL）的悬浮液，超声处理15 min，再将其置于激光纳米粒度仪中，对纳米淀粉酯的粒度分布进行检测，设置分散剂为水，颗粒折光率为1.530，在20 ℃下检测3 次，取平均值。

1.3.5 纳米淀粉酯Zeta电位的测定

将纳米淀粉酯以3∶1 000（g/mL）的比例置于去离子水中，超声处理15 min，再将其置于激光纳米粒度仪中，对纳米淀粉酯Zeta电位进行检测。在KCl浓度为0.05 mol/L条件下，研究不同pH值（3.0～9.0）对纳米淀粉酯Zeta电位的影响；同时，在pH 7.0条件下，研究不同KCl浓度（0.001～0.2 mol/L）对纳米淀粉酯Zeta电位的影响。

1.3.6 Pickering乳液的制备及稳定性测定

将纳米淀粉酯按照一定的比例置于玉米油中，利用超声波细胞破碎仪，在功率60 Hz下超声处理1 min，再将玉米油以1∶10（V/V）的比例加入去离子水中，采用间歇式超声处理30 min，制得纳米淀粉酯添加量分别为0.5、1.25、2.0 g/100 mL 3 个梯度的Pickering乳液。

分别取纳米淀粉酯添加量2.0 g/100 mL、KCl浓度0.005 mol/L制备Pickering乳液，在pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0 4 个梯度下测定Pickering乳液稳定性的变化趋势；取纳米淀粉酯添加量2.0 g/100 mL，并在pH 7.0以及KCl浓度分别为0.005、0.01、0.05 mol/L和0.1 mol/L 4 个梯度下测定Pickering乳液稳定性的变化趋势。

1.3.7 Pickering乳液的微观结构

将荧光染色剂罗丹明B以1∶1（V/V）的比例溶解于去离子水中，再将其稀释1 000 倍，可对Pickering乳液样品中的纳米淀粉酯进行染色。具体方法如下：取Pickering乳液样品1 mL，加入上述稀释染色液0.5 mL，避光搅拌5 min。取洁净载玻片，将经染色处理后的乳液10 μL滴加到载玻片上，加盖洁净的盖玻片，于倒置荧光显微镜载物台上进行观察。

1.4 数据统计

全部实验重复测定3 次，取平均值。淀粉纳米酯粒径分布、Pickering乳液分散相油滴尺寸均采用仪器自带软件进行测量和分析，利用Origin 8.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 纳米淀粉酯的表征

图1 玉米淀粉纳米颗粒（a）与纳米淀粉酯（b）的红外光谱图Fig. 1 Infrared spectra of corn starch nanoparticles (a) and starch ester nanoparticles (b)

玉米淀粉与OSA进行酯化反应生成辛烯基琥珀酸淀粉酯，其是GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中批准使用的食品添加剂。在反应过程中，琥珀酸酐上的羰基取代淀粉分子上的羟基进而完成酯化反应，因此，采用傅里变换叶红外光谱对淀粉分子结构进行检测，以确定淀粉分子中是否引入了羰基基团。如图1所示，玉米淀粉纳米颗粒在波数为3 408 cm-1和2 933 cm-1处均有特征吸收峰，这分别是由葡萄糖基上O—H的伸缩振动和C—H的伸缩振动生成的；此外，玉米淀粉纳米颗粒在波长1 647 cm-1处有特征吸收峰，这是由淀粉中残存的结合水导致的；玉米淀粉纳米颗粒在波数为929 cm-1和1 157 cm-1处均有特征吸收峰，这是由C—O的伸缩振动生成的[10-11]。与玉米淀粉纳米颗粒红外谱图相比，纳米淀粉酯在波数为1 568 cm-1和1 720 cm-1处出现2 个新的特征吸收峰，前者是由于羧基的不对称伸缩振动而产生的[12]；后者是C＝O的伸缩振动产生的，这说明玉米淀粉纳米颗粒与OSA完成了酯化反应中羟基的取代，生成了酯羰基[13]。

2.2 纳米淀粉酯粒径分布

图2 纳米淀粉酯粒径分布Fig. 2 Size distribution of starch ester nanoparticles

由图2可以看出，纳米淀粉酯的粒径主要分布在100～550 nm范围内，呈单峰分布，大多数纳米淀粉酯的粒径集中分布在210～220 nm，这是由于本研究采用醇沉法[14]作为玉米淀粉纳米颗粒的制备方法，研究发现，在将玉米淀粉胶状液滴加到无水乙醇的过程中，无水乙醇体积对制成的玉米淀粉纳米颗粒的粒径具有显著影响：在一定范围内，无水乙醇所占的比例越高，制成的玉米淀粉纳米颗粒的粒径越小；相反，无水乙醇所占的比例越低，制成的玉米淀粉纳米颗粒的粒径越大[15-16]。因此，本研究通过控制醇沉实验中无水乙醇的体积，获得合适粒径的玉米淀粉纳米颗粒，其中多数颗粒粒度分布为210～220 nm。由于颗粒粒径是Pickering乳液制备的重要因素之一，所以具有合适粒径的纳米淀粉酯是Pickering乳液制备的必要条件[17-18]。

2.3 pH值对纳米淀粉酯Zeta电位的影响

图3 pH值对纳米淀粉酯Zeta电位的影响Fig. 3 Zeta potential of starch ester nanoparticles at different pH values

如图3所示，在体系pH值由3.0升高至9.0过程中，纳米淀粉酯所带负电荷的数量呈现不同幅度的增加趋势；当pH 3.0时，纳米淀粉酯所带的负电荷最少（-1.01±0.31）mV；随着pH值的升高，纳米淀粉酯所带的负电荷逐渐增多；当pH增加至8.0时，纳米淀粉酯所带的负电荷最多（-5.69±0.19）mV；当pH值为9.0时，纳米淀粉酯所带的负电荷数稍有降低（-5.39±0.27）mV；这是由于玉米淀粉纳米颗粒的酯化改性是在碱性条件下完成，酯化反应为玉米淀粉纳米颗粒的表面连接了烯基基团，致使淀粉纳米颗粒带负电[19]。随着pH值的增加，纳米淀粉酯所带负电荷的数量增加，这可能是由于纳米淀粉酯表面的羧酸基团发生去质子化反应导致的[20]。Kargar[21]和Yu Dehai[22]等分别研究了微晶纤维素和氟化钠改性的蒙脱土，均发现颗粒的电位随体系pH值改变而改变，这与本实验纳米淀粉酯所带电荷变化趋势一致。

2.4 KCl浓度对纳米淀粉酯电位的影响

图4 KCl浓度对纳米淀粉酯Zeta电位的影响Fig. 4 Zeta potential of starch ester nanoparticles at different KCl concentrations

如图4所示，在pH 7.0条件下，体系中KCl的浓度由0 mol/L增加至0.2 mol/L过程中，随着KCl浓度的增加，纳米淀粉酯所带负电荷数发生了显著的下降；当KCl浓度为0 mol/L时，纳米淀粉酯所带的负电荷最多（-25.23±0.53）mV，主要因为在离子强度相对较低并且pH 7.0条件下，纳米淀粉酯表面电荷的作用力以静电斥力主导，静电斥力在维持Pickering乳液稳定性方面起着至关重要的作用[23-24]。随着KCl浓度的增加，纳米淀粉酯所带的负电荷逐渐降低，当KCl浓度增加至0.1 mol/L时，纳米淀粉酯所带的负电荷最少（-3.41±0.27）mV；继续增加KCl浓度，纳米淀粉酯所带电荷数变化不明显，说明KCl浓度超过0.1 mol/L即能达到屏蔽纳米淀粉酯表面电荷的效果。

2.5 纳米淀粉酯添加量对Pickering乳液稳定性的影响

相关研究表明，Pickering乳液中颗粒含量变化对其分散相油滴的尺寸具有重要的影响，适宜的颗粒含量对于维持乳液稳定性、防止乳析、聚结等不稳定现象的发生起着重要的作用[25]。如图5所示，纳米淀粉酯的添加量对乳液体系稳定性具有显著影响。由图6可知，当体系中纳米淀粉酯的添加量由0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL时，乳液体系中分散相油滴直径呈明显下降趋势；其中，当纳米淀粉酯添加量为0.5 g/100 mL时，乳液体系出现大量直径超过20 μm的油滴（图6a）；由于油滴直径与上浮速度成正比，所以，在这种乳液体系中，油脂更倾向于聚集、上浮，进而导致油水分离的现象发生（图5）。当纳米淀粉酯的添加量增加至1.25 g/100 mL时，乳液体系中直径超过20 μm的油滴数量明显减少（图6b）；当纳米淀粉酯的添加量增加至2.0 g/100 mL时，乳液体系中分散相油滴的直径大幅度下降，在显微镜视野里没有发现直径超过20 μm的油滴，绝大多数油滴的直径均小于1 μm，并且呈均匀分布状态（图6c）。为观察纳米淀粉酯在乳液体系中的分布情况，进而研究其在Pickering乳液稳定性方面所发挥的作用，本研究采用荧光颜色剂罗丹明B与纳米淀粉酯共价相连，使纳米淀粉酯显红色。如图6d所示，在荧光显微镜视野下，分布着大量红色圆环，此红色圆环为罗丹明B标记的纳米淀粉酯，这些纳米淀粉酯在油滴表面形成了一道致密的屏障，紧密的包裹着分散相油滴，阻碍油滴之间发生聚结。有研究表明，OSA酯化反应不仅使玉米淀粉纳米颗粒获得了疏水基团，而且使其具备一定的表面活性[26]。Wu Jiangde等[27]研究发现在一定范围内增加颗粒添加量能够提高Pickering乳液的稳定性。本研究制备的纳米淀粉酯能够吸附于油水界面，并且添加量为2.0 g/100 mL的纳米淀粉酯能够完全的覆盖在油水界面上，在分散相油滴之间形成物理屏障，抑制油脂聚结，有效发挥稳定Pickering乳液的作用。

图5 不同添加量纳米淀粉酯稳定的食品级Pickering乳液Fig. 5 Food-grade Pickering emulsions stabilized by nanometer starch esters

图6 不同添加量的纳米淀粉酯颗粒稳定的Pickering乳液的显微镜观察图Fig. 6 Optical microscopic images of Pickering emulsions stabilized by starch ester nanoparticles at different concentrations

2.6 体系pH值对Pickering乳液稳定性的影响

图7 pH值对食品级Pickering乳液稳定性的影响Fig. 7 Stability of food-grade Pickering emulsions at different pH values

图8 pH值对食品级Pickering乳液稳定性影响的光学显微镜观察图Fig. 8 Optical microscopic images of food-grade Pickering emulsions at different pH values

如图7所示，当pH值为5.0时，Pickering乳液发生明显的油水分离现象。由图8可知，体系pH值由5.0升高至8.0时，乳液体系中分散相油滴的直径发生明显变化；当pH值为5.0时，乳液体系中分布着数量较多的大油滴，其中最大油滴的直径可达13.31 μm；当pH值升高至6.0时，体系中油滴的直径发生大幅度下降，其中最大油滴的直径仅为3.33 μm，并且呈均匀分布状态；继续升高pH值至7.0，发现体系中的油滴直径开始变大，其中最大的油滴直径为7.17 μm；继续升高体系pH值至8.0，体系中再次出现大量的直径较大的油滴，其中直径最大为14.85 μm。有研究表明，体系pH值的变化能影响颗粒表面离子基团的电荷数，进而控制颗粒的疏水性，对Pickering乳液的稳定性具有重要的作用。当体系pH值为5.0时，纳米淀粉酯所带的负电荷极少，仅为-2.37 mV（图3），这导致纳米淀粉酯和油水界面之间的静电吸引力降低，这会阻碍纳米淀粉酯吸附到油水界面上，进而不能维持Pickering乳液的稳定，因此，发生明显的乳析现象（图7）。然而，当pH值升高至8.0时，纳米淀粉酯易发生聚集、沉淀，因此不能有效吸附到油水界面上，使Pickering乳液的失去稳定性。Yang Fei等[28]研究发现在一定范围内增加体系pH值能够增加油水界面负电荷数，并能降低颗粒之间的静电斥力，有助于颗粒吸附到油水界面，增强乳液的稳定性。

2.7 离子强度对Pickering乳液稳定性的影响

图9 KCl浓度对食品级Pickering乳液稳定性的影响Fig. 9 Stability of food-grade Pickering emulsions at different KCl concentrations

图10 KCl浓度对食品级Pickering乳液稳定性影响的显微镜图Fig. 10 Optical microscopic images of food-grade Pickering emulsions at KCl concentrations

在乳液体系中，离子强度能够通过静电屏蔽作用降低油滴之间的静电斥力，进而降低乳液的稳定性。如图9、10所示，在KCl浓度由0.005 mol/L增加至0.01 mol/L过程中，乳液中分散相油滴的直径发生显著增加，其中当KCl浓度为0.005 mol/L时，油滴直径小且分布均匀；当KCl浓度增加至0.05 mol/L时，乳液发生严重的油水分离现象，并且出现直径超过20 μm的油滴；继续增加KCl浓度至0.1 mol/L，体系油水分离的现象加剧，并且大量出现直径超过30 μm的油滴，这说明油滴之间发生了聚结。上述现象表明增加体系离子强度，会导致纳米淀粉酯表面电荷下降（图3），致使纳米淀粉酯无法吸附在油水界面上，降低了油滴之间的静电斥力而导致油滴发生絮凝现象，并使Pickering乳液失去稳定性。Ettoumi等[29]研究发现由扁豆蛋白颗粒稳定的Pickering乳液体系对离子强度的变化十分敏感，当KCl浓度为50 mmol/L时，即会引发分散相与连续相的分离。此外，本研究发现增加离子强度会造成油滴表面电荷下降甚至会屏蔽油滴表面电荷，进而导致分散相油滴聚结而上浮，说明离子强度对Pickering乳液稳定性具有重要的影响[30]。

3 结 论

以醇沉和酯化相结合的方法制备纳米淀粉酯，这种颗粒安全、有效，可以直接应用于制备食品级Pickering乳液。通过调节纳米淀粉酯添加量，可以得到不同稳定性的水包油型Pickering乳液；当纳米淀粉酯添加量为2.0 g/100 mL时，能够制备出具有较强稳定性的Pickering乳液。

纳米淀粉酯的电位受体系pH值和离子强度的影响。在溶液体系中，纳米淀粉酯表面带负电，并且随pH值以及离子强度的改变而发生改变。在pH 3.0升高至pH 9.0过程中，纳米淀粉酯所带负电荷数呈明显增加趋势；在KCl浓度由0 mol/L增加至0.2 mol/L过程中，纳米淀粉酯所带负电荷数呈明显下降趋势；在低pH值或高离子强度条件下，纳米淀粉酯所带负电荷最少。

Pickering乳液的稳定性受体系纳米淀粉酯含量、pH值和离子强度的影响。在乳液体系中，纳米淀粉酯含量由0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL，分散相油滴的直径呈显著下降趋势；利用荧光显微镜对Pickering乳液微观结构进行观察，纳米淀粉酯在分散相油滴的表面形成一道致密的物理屏障，抑制油滴的聚结；在体系pH 5.0升高至pH 8.0过程中，分散相油滴的直径呈现先减小后增大的趋势，其中在pH 6.0下，Pickering乳液分散相油滴的直径最小；在乳液体系KCl浓度由0.005 mol/L增加至0.1 mol/L过程中，分散相油滴的直径明显增加，其中当KCl浓度0.005 mol/L时，Pickering乳液中分散相油滴的直径最小。