拐枣果蔬酵素发酵条件的优化

肖梦月，曹新志*，张楷正，赵迎庆，胡 琴

（1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.山东凤凰生物有限公司，山东 泰安 271000）

拐枣学名枳椇（Hovenia acerba），又因其形似“万”字又得名万寿果，其富含糖类物质和生物活性物质。其中糖类物质含量极高，总糖含量可达249.24 mg/g，还原糖含量可达167.57 mg/g[1]。现有的研究表明，拐枣中含有多种脂肪酸、氨基酸、维生素和酚类化合物，这些成分可以直接或间接影响人体代谢，与健康密切相关[2-3]。相比一般的水果，拐枣中的多酚含量更为丰富，可达2.68 mg/g[4]，有研究发现，多酚具有抗肿瘤、抗病毒、抗诱变、预防心脑血管疾病等药理作用并且还具有抗衰老、美白保湿等作用[5-6]。虽然拐枣果实营养价值极高，但因其形态特殊，所以可供直接食用的可食部分较少，并且略带涩味，拐枣在我国的种植面积不大，甚至在有些农村地区已经绝迹。目前关于拐枣研究不多，现有产品有限，主要有拐枣酒，拐枣饮料和拐枣醋，还有很多研究是关于相关成分的提取和检测[7-9]。将拐枣应用于酵素产品，有助于提高拐枣农产品的加工利用率，有望于将拐枣的有益物质更好的得以利用。酵素本意指酶，现主要指各种原料经微生物发酵后所得到的成品[10]。酵素制品可以在保留原料的有益成分的基础上增加更多的有益物质，有很多研究也证实了酵素所具有的一些功能特性，如解酒保肝、润肠通便和抗氧化等[11-14]。日本在20世纪80年代就已经将酵素产品的生成作为技术来研究并进入应用阶段，每天有超过2 000万人在服用酵素产品，食用酵素在日本一年可达1 000亿日元的消费额[15]。我国酵素行业起步较晚，目前尚少见到将拐枣全果应用于酵素制作的相关研究，并且将四川泡菜水应用于酵素发酵的研究也比较少见。四川泡菜水中微生物种类丰富，不仅含有乳酸菌而且还含有酵母菌和醋酸菌等[16]。本试验以拐枣以及多种果蔬（拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）作为混合原料制作酵素，将四川泡菜水用于酵素的发酵，以还原力和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）酶活力作为检测指标，探索不同条件对拐枣果蔬酵素品质的影响[17-18]。通过单因素试验和正交试验，最终得到拐枣果蔬酵素的最佳发酵条件。具有拐枣风味的酵素产品的开发，不仅充分利用了拐枣中多酚含量高的优势，而且为提高拐枣的加工利用率提供了方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

红糖、白砂糖、各种果蔬（拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）、高活性安琪酵母：宜宾某超市；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：本实验室保藏；四川泡菜水：实验室自制。

1.1.2 化学试剂

没食子酸、无水碳酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、十二水磷酸氢二钠、盐酸、二水磷酸二氢钠（均为分析纯）：成都市科隆化工试剂厂；福林酚试剂（分析纯）：南京奥多福尼生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基：牛肉膏6.0 g，蛋白胨6.0 g，酵母浸粉3.0 g，乙酸钠3.0 g，磷酸氢二钾1.2 g，吐温-80（聚山梨脂-80）0.6mL，葡萄糖12.0g，MnSO4·4H2O0.15g，MgSO4·7H2O0.35g，柠檬酸铵1.2 g，蒸馏水600 mL，pH 6.2±0.2。121 ℃、0.1 MPa高压灭菌20 min。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上再加琼脂15.0 g。121 ℃、0.1 MPa高压灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

GZ-250-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；KQ5200V超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TG-16台式高速离心机：四川蜀科仪器有限公司；TGL-16B离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-1000紫外可见分光光度计：上海翱艺仪器有限公司；868Thermo pH计：热电（上海）仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 拐枣果蔬酵素工艺流程及操作要点

果蔬清洗→预处理→混合→调配→装罐密封→一次发酵→过滤→二次发酵→拐枣果蔬酵素

操作要点：

预处理：将拐枣、橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿等果蔬清洗干净，并于通风处自然晾干水分后去皮、去核并切丁，将切好的果蔬按质量比为1∶1混合得到混合果蔬。

四川泡菜水的制备：芹菜2份、小米辣1份、生姜1份、泡萝卜6份均清洗晾干备用。饮用水烧开晾至25～30 ℃，按8%的添加量加入食用盐搅拌溶解。将经预处理好的蔬菜装入泡菜坛子，然后倒入盐水，直至淹没蔬菜，并在最上面撒一层大约0.03 cm厚度的食盐。封罐：盖上泡菜坛盖以水封。定期检查水封的水量，水量低于坛沿2/3立即将水补齐至坛沿；3月后即可获得四川泡菜水。

菌株活化：酵母菌加入10倍蒸馏水于30 ℃水浴0.5 h活化酵母菌，植物乳杆菌于MRS液体培养基中37 ℃培养2 d，即可得到乳酸菌活化液。

调配：混合果蔬中加入35%混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1），再分别加入一定量的四川泡菜水、活化酵母菌及植物乳杆菌混匀。

装罐密封：装罐量为容积的80%，不可装太满。

一次发酵：在35 ℃条件下进行恒温发酵15 d，前7 d每天搅拌一次，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后，即视为达到发酵终点。

过滤：一次发酵完成后用双层纱布过滤。

二次发酵：将过滤后的一次发酵液密封后于常温避光处二次发酵成熟30 d，得拐枣果蔬酵素。

1.3.2 检测方法

（1）总酚含量的测定

样液预处理：取发酵液在4 000 r/min条件下离心15 min。

参考福林酚比色法测定核桃青皮果蔬酵素中的总酚含量[18]，在25 mL刻度试管中加入经稀释10倍的样液，然后加入2.5 mL10%的福林酚试剂，混匀之后静置3 min，最后加入1 mL 12%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25 mL，置于45 ℃水浴锅中遮光显色30 min，取出后迅速冷却于696 nm波长条件下测定吸光度值。以不同质量浓度的没食子酸标准溶液代替样液测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.0720 0x+0.005 6，R2=0.999 6。

（2）还原力的检测

参考毛酸浆酵素还原力的测定方法[19]，取经预处理后的发酵液0.2 mL，加入2.5 mL浓度为0.2 moL/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6），然后加入质量分数为10%的铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷却，然后加入2.5 mL 体积分数为20%的三氯乙酸溶液，于3 600 r/min离心15 min后立即取上清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL和0.1%三氯化铁0.5 mL。以去离子水作参比在波长700 nm处测定吸光度值（OD700nm值）。吸光度值越大，说明还原能力越强，抗氧化效果越好。

（3）SOD酶活力的检测

参考国标GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》[20]，于25 ℃左右，取经预处理并适当稀释的样液0.2 mL于试管中，然后依次将2.35 mL浓度为0.1 moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液（pH为8.2，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na））、1.8 mL蒸馏水、0.15 mL 4.5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后立即倒入石英比色皿中在波长325 nm条件下分别测定初始时和1 min后的吸光度值，二者之差则为A1，空白比色皿用10 mmol/L盐酸调零，同样地用蒸馏水代替样液测定吸光度值A0，SOD酶活性计算公式如下：

超氧化物歧化酶活力定义：25 ℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD量为一个活力单位（U）。

1.3.3 原料对总酚含量和发酵时间的影响

将经预处理后的除拐枣外的所有果蔬原料（橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿）按1∶1质量比混合得到混合果蔬原料，然后按照不同拐枣添加量分组，第一组不添加拐枣，第二组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶4，第三组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶3。然后分别按原料∶白砂糖∶红糖=4∶1∶1（g∶g）进行调配，加入2%的泡菜水置于35 ℃条件下进行发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定取样测定其总酚含量。

1.3.4 糖的种类对发酵的影响

将经预处理后的的除拐枣外的所有果蔬原料（橘子、苹果、梨、萝卜、卷心菜、菠菜、柠檬、土豆、藕、西红柿按1∶1的质量比混合）混合得到混合果蔬原料，将拐枣与混合果蔬原料按1∶4的质量比混合，等量分为3个样品组，分别添加白砂糖50%、红糖50%、混合糖50%，3个样品组菌接种泡菜水2%，置于35 ℃培养箱中恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。

1.3.5 发酵工艺优化单因素试验

（1）加糖量的选择

前处理方式不变，将样品进行编号1～4号，在调配时分别加入混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）20%、30%、40%、50%，每个样品均添加2%的泡菜水，然后在35 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。

（2）菌种的选择

前处理方式不变，调配时加入30%的混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1），将样品进行编号1～6号，分别加入酵母菌2%、4%，乳酸菌2%、4%，四川泡菜水2%、4%。在35 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。

（3）发酵温度的选择

前处理方式不变，调配时加入30%的混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）与2%的泡菜水，将样品进行编号1～4号，分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃条件下进行恒温发酵，每隔3 d取发酵液测定pH值，直至pH值稳定不再下降后取发酵液经预处理后进行还原力和SOD酶活力的测定。

1.3.6 发酵工艺优化正交试验

在单因素的基础上设计正交试验，考察混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）添加量（A）、发酵温度（B）和四川泡菜水接种量（C）3个因素共同作用对拐枣果蔬酵素的影响，一次发酵结束后对发酵液的还原力和SOD酶活性进行测定，每个样品重复测3次，最后结果取平均值，根据测定结果最终选择出最优工艺条件，正交试验因素与水平见表1。

表1 发酵工艺优化正交因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

2 结果与分析

2.1 原料对总酚含量和发酵时间的影响

图1 不同原料对总酚含量和发酵时间的影响Fig.1 Effect of different raw materials on total phenol content and fermentation time

由图1可知，不同拐枣添加量对酵素总酚含量影响较大，拐枣的加入能够明显提升酵素中总酚含量，其中第一组无拐枣组的总酚含量为1.32 mg/mL，第二组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶4时，总酚含量为2.35 mg/mL，第三组拐枣与混合果蔬的质量比为1∶3时，总酚含量上升至2.63 mg/mL，上升幅度不是很明显。同时可以看出拐枣的添加量对发酵时间有较明显的影响，拐枣的加入会延长发酵时间。所以综合两种因素考虑，最终选择拐枣与混合果蔬的最适质量比为1∶4。

2.2 糖种类选择结果

由图2可知，添加了混合糖的酵素样品的SOD酶活力和还原力明显高于单一糖种类样品，且仅添加白糖的样品组SOD酶和还原力最低分别为121.6 U/mL和1.534（OD700nm值），这说明红糖和白砂糖混合发酵效果要优于单一糖种类发酵，这可能是因为红糖相比白砂糖含更多的微量元素，较适宜微生物发酵。但是仅用红糖进行发酵，所得酵素的还原力和SOD酶活力也低于混合糖发酵，这可能是因为只添加红糖发酵酵素样品更容易受到其他杂菌的影响，最终导致酵素的品质比混合糖发酵酵素品质低。所以选择砂糖和红糖最适质量比为1∶1。

图2 糖种类对还原力和超氧化歧化酶活力的影响Fig.2 Effect of sugar types on reducing power and superoxide dismutase activity

2.3 发酵工艺优化单因素试验

2.3.1 加糖量的选择

图3 混合糖添加量对还原力和超氧化歧化酶活力的影响Fig.3 Effect of mixed sugar addition on reducing power and superoxide dismutase activity

由图3可知，糖的添加量对酵素的SOD酶活力和还原力均会产生影响，随着糖添加量的增大，SOD酶活力出现了先增大后降低的现象，这可能是过高的糖添加反而会抑制微生物的生长繁殖，最终导致所产酶活力下降。还原力是随着糖添加量的增大而一直增大，这可能是由于糖添加量的增多，被微生物所分解成为还原糖的量也越大，所以最终导致发酵结束时还原力很大。但是总体来说30%的混合糖添加量与50%混合糖添加量条件下还原力和SOD酶活力分别为1.345（OD700nm值）、1.502（OD700nm值）和171.2 U/mL、156.2 U/mL，其中还原力差别不是特别明显，而SOD酶活力30%糖添加量情况下更多，且较多的糖添加量还会延长发酵时间。所以选择混合糖（砂糖和红糖质量比为1∶1）的最适添加量为30%。

2.3.2 发酵温度选择结果

图4 发酵温度对还原力和超氧化歧化酶活力的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on reducing power and superoxide dismutase activity

由图4可知，随着发酵温度的升高，酵素样品的SOD酶活性和还原力均呈现出先升高后降低的趋势，其中30 ℃和35 ℃条件下发酵的酵素样品的还原力和SOD酶活性明显高于25 ℃和40 ℃条件下发酵的，这说明适宜的温度对发酵效果十分重要。25 ℃发酵温度过低，可能不适宜目的微生物生长，所以导致发酵不完全且所需发酵时间较长而40 ℃发酵温度过高，可能会抑制目的微生物生长，并且40 ℃样品的活力较25 ℃更低。35 ℃样品两者指标均最高还原力和SOD酶活力分别为1.932（OD700nm值）、205.4 U/mL。所以选择最适发酵温度为35 ℃。

2.3.3 菌种的选择结果

图5 不同菌种对还原力和超氧化歧化酶活力的影响Fig.5 Effect of different strains reducing power and superoxide dismutase activity

由图5可知，加入不同的菌种对酵素样品的SOD酶活力和还原力有很大影响，且由图可知影响效果为：泡菜水＞乳酸菌＞酵母菌。这可能是由于四川泡菜水中微生物种类丰富，不仅有多种乳酸菌，还有醋酸菌和酵母菌等，并且本试验用的老泡菜水（制作超过3个月以上）菌落总数达105CFU/mL以上，产酸能力强。所以选择泡菜水作为接下来正交试验的菌种。

2.4 发酵工艺优化正交试验结果

在单因素的基础上设计正交试验，以发酵液的还原力和SOD酶活性为考察指标，考察混合糖添加量（A），发酵温度（B）和四川泡菜水接种量（C）3个因素共同作用对拐枣果蔬酵素的影响，正交试验结果与分析见表2。

表2 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表2可知，影响酵素样品SOD酶活力和还原力的因素主次顺序为A＞B＞C，混合糖的添加量是影响酵素样品的SOD酶活力和还原力的最主要的因素，这可能是由于本试验的酵素样品都发酵较完全，所以糖的添加量在较大程度上决定了发酵的周期，因而影响了酵素的产物。对于SOD酶活力和还原力而言，两种指标均越大越好，所以从两种指标都可得出最优发酵工艺组合是A2B2C3，即拐枣果蔬酵素的最佳发酵工艺为混合糖添加量30%，发酵温度35 ℃，四川泡菜水接种量4%。在此最佳发酵工艺条件下，SOD酶活力及还原力（OD700nm值）分别为270 U/mL和2.165（OD700nm值）。

3 结论

本试验以拐枣和多种果蔬为原料，以四川老泡菜水为菌种母液，通过对不同原料发酵的酵素样品的总酚检测，以拐枣与混合果蔬按照1∶4质量比进行拐枣果蔬酵素的研制，最终得出拐枣果蔬酵素的最佳工艺条件为混合糖添加量30%、发酵温度35 ℃、四川泡菜水接种量为4%，发酵15 d，在此优化条件下得到的酵素超氧物歧化酶（SOD）活性为270 U/mL，还原力为2.165（OD700nm值），总酚含量为3.38 mg/mL，经过30 d熟成后颜色呈悦人的浅红棕色，发酵液清澈，酸甜适口，香气浓郁，并无不良风味。