不同菌种发酵对纳豆激酶活性及黏液成分影响

牛红红，苗欣宇，李 达，迟燕平，刘佳彤，郑 丽，苏 颖，王景会

（吉林省农业科学院 农产品加工研究所，吉林 长春 130033）

纳豆是黄豆经纳豆菌发酵而成的豆制品。纳豆菌别称纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）纳豆菌亚种[1-2]，是一种对人体非常有益的可食用益生菌。纳豆菌在发酵纳豆的过程中产生多种酶，在酶的作用下，黄豆不易被人体消化吸收的脂肪、蛋白质、碳水化合物等大分子物质，被转化为更易被人体吸收的小分子营养成分，如氨基酸、有机酸、寡聚糖等[1-3]；同时产生纳豆特有的活性成分，纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种丝氨酸蛋白酶，因具有治疗心血管疾病、预防骨质疏松等多种保健功而效备受关注[4-5]。发酵合格的纳豆表面有一层黏液，挑起时呈拉丝状，具有纳豆特殊的香味[6-7]。纳豆黏液含有大量活性物质如NK、血管紧张肽转化酶抑制剂、多糖等，具有抗肿瘤、溶栓、降压、抗氧化等多种保健功能[8]，是评价纳豆品质的一个重要指标[9]。

纳豆菌影响纳豆品质，NK活力、黏液营养物质，因此筛选发酵性能好的纳豆菌至关重要。国内外很多学者以NK活力为评价指标，开展了纳豆菌筛选和培育研究。KWON E Y等[10]首先通过纤溶活性筛选，再通过16S rRNA技术鉴定枯草芽孢；刘梦洁等[1]则将纤溶活性筛选和纳豆激酶基因鉴定相结合，可准确筛选到NK高产菌株；张杰等[11]利用超声波和紫外线对纳豆菌进行复合诱变处理，筛选出NK高产突变菌株；LEE B H等[12]对比分析了4株枯草芽孢杆菌对纳豆的发酵效果。关于纳豆黏液成分组成，已开展了相关研究[13-14]，但是关于不同菌株对NK活力、纳豆黏液各营养指标的影响，尚鲜见报道。

本研究以实验室前期从不同地区、不同稻草中已经分离筛选的具有较好发酵性能的5株纳豆菌为出发菌株，进行纳豆发酵实验，通过比较分析NK活力、纳豆黏液中的营养，评价不同菌株发酵性能，以期为纳豆生产用菌筛选提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与材料

5株纳豆菌（编号分别为JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214）：吉林省农业科学院农产品加工所食品微生物团队保藏（分离菌株样品分别来源于吉林省通化、公主岭、通化、长春、辽源地区的稻草；5株菌产地、水稻品种不相同）；黄豆（小粒豆，吉林省通化市）：市售。

1.1.2 化学试剂

牛凝血酶（2000U/mg）、牛纤维蛋白原（纯度＞85%）：沈阳拜英生物技术有限公司；注射用尿激酶标准品（1000IU/mg）：武汉人福药业有限责任公司；琼脂糖（分析纯）：法国Biowest公司。酵母浸粉、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

改良LB液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉3 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖3 g/L，pH 6.0～6.5，121 ℃高压灭菌20 min。

改良LB固体培养基：改良LB液体培养基添加16 g/L琼脂粉。

1.2 仪器与设备

MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：日本Sanyo公司；3K15冷冻离心机：美国Sigma公司；Cary300紫外可见光分光光度计：美国Varian公司；2300 k凯氏定氮仪：丹麦FOSS公司；S433D全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司；HZQ-X100全温振荡培养箱、DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；DL-CJ-2ND型超级洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及发酵液制备

菌种活化：将甘油管保藏的5株不同菌株，接种量2%，接入装有50 mL改良LB培养基的100 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min摇瓶培养18 h。

发酵培养：取4 mL活化好的菌液转接于装有200 mL LB培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min培养4 h即为发酵液。

1.3.2 纳豆加工工艺流程

黄豆（精选去除杂物）→浸泡（12 h）→蒸煮及灭菌（100 ℃、2 h）→冷却至室温→接菌（接菌量4%）→发酵（37 ℃、18 h）→后熟（4 ℃冰箱，18 h）

1.3.3 分析检测

（1）纳豆黏液产率计算

参照刘晶等[15]的测定方法，稍作改动。

（2）纳豆黏液成分测定

纳豆黏液待测样品制备：取100.00 g纳豆，用100 mL生理盐水，将纳豆表面黏液全部清洗转移至离心管中。分别测定纳豆黏液中水分（直接干燥法[16]）、可溶性总糖（苯酚-浓硫酸法[17]）、总蛋白含量（凯氏定氮法[18]）、水解氨基酸及游离氨基酸（全自动氨基酸分析仪[19]，水解氨基酸用HCl水解法，游离氨基酸用磺基水杨酸法，仪器条件相同）。

（3）发酵液纳豆活菌数的测定

采用稀释平板法测定发酵液纳豆活菌数[20]，稍作改动。改良LB平板，37 ℃恒温静置培养12 h，统计单菌落个数，计算纳豆活菌数，控制发酵种子液活菌数在1.0×108～3.0×108CFU/g之间，以保持5株菌种发酵液活力一致。

1.3.4 纳豆激酶活性的测定

纳豆激酶活测定：参照琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性[21]，并作改进。

尿激酶标准曲线绘制：用生理盐水将注射用尿激酶，分别配制成2 000 IU/mL、1 000 IU/mL、800 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL尿激酶标准溶液，以尿激酶酶活对数值为横坐标（x），尿激酶溶圈面积为纵坐标（y），绘制尿激酶标准曲线，得到回归方程为y=0.223 5x+2.066 5，相关系数R2为0.997。

纳豆激酶酶活定义：在37 ℃、1 min内水解纤维蛋白产生0.01 mm2透明圈的所需酶量为1个酶活单位（IU）[21]。

纳豆样品测定：纳豆研磨均匀，取5.00 g，加入生理盐水50 mL，37 ℃、180 r/min振荡提取30 min，14 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液，其余与尿激酶标准曲线方法相同。由尿激酶标准曲线回归方程计算出被测样品的纳豆激酶酶活力。

1.3.5 数据处理

采用Excel 2010进行数据统计及制图，SPSS 17.0软件中单因素方差方法，用Duncan多重比较对数据进行差异显著性检验分析，以P＜0.05为差异显著，数据以平均值±标准差的形式来表示。

2 结果与分析

2.1 不同菌种发酵纳豆黏液产率及活菌数

不同纳豆菌所产纳豆中黏液产率及活菌数分析结果见表1。

表1 不同纳豆菌发酵纳豆黏液产率及活菌数Table 1 Yield and viable count of natto mucus fermented by different Bacillus natto

由于实验采用同一种黄豆，接菌量及生产工艺相同，所以含水量相同[6]。在含水量相同的情况下，黏液产率不同，是由于发酵菌株不同造成的。因为纳豆黏液是纳豆菌从黄豆成分中降解、合成的，其产率和纳豆菌数量及分泌各种酶的能力有关。纳豆菌数量多、活性则高产酶能力强，黏液产率高，纳豆感官湿润、口感酥软，品质较优。

由表1可知，纳豆黏液的产率与所接的纳豆菌种有关。5株菌种中，菌株JLGZL-018纳豆黏液产率最高为（20.17±1.72）%，并与其他4株差异显著（P＜0.05）。5株菌发酵的纳豆活菌数在5.45×108～1.30×109CFU/g之间。其中，菌株JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157纳豆样品活菌数较多，均＞109CFU/g。因为纳豆菌本身具有溶栓、降压、抗炎等保健功能，所以活菌数是判定纳豆品质的重要指标之一[7]。5株纳豆菌由于来源不同，自身活性及生长性能不一致，所以在相同发酵条件下，活菌数也不同。其中菌株JLGZL-018，活菌数较多为1.23×109CFU/g，且黏液产率也最高，同时其他4株纳豆菌也表现出黏液产率与活菌数量呈正相关。

2.2 纳豆激酶活力检测结果

由于NK是纳豆生产过程中特有的一种酶，具有很强的溶栓效果，并且口服安全性高，是判定纳豆产品品质的一个重要指标[7]。不同菌株发酵的纳豆中所含NK的活性测定结果见图1。

图1 不同菌种对纳豆激酶活性的影响Fig.1 Effect of different strains on nattokinase activity

由图1可知，5株纳豆菌发酵，NK活性在2086～4167IU/g之间，其中菌株JLGZL-018纳豆样品的激酶活性显著高于其他菌株发酵纳豆（P＜0.05），为4 167 IU/g。NK是纳豆菌发酵过程中产生的一种蛋白酶，5株菌来源不同，其产生NK活力不同。同时从NK活力结果来看，活菌数、黏液产率较高的JLGZL-018菌株对应的NK活性较高，反之亦然，说明了NK活力与活菌数相关。已报道的商业化纳豆产品中NK活力范围一般在800～4 000 IU/g[22]，而菌株JLGZL-018生产的NK活力高于商业化NK活力水平，具有应用前景。

2.3 不同菌种发酵纳豆对其黏液的影响

2.3.1 不同菌种发酵纳豆对其黏液总蛋白含量影响

黄豆的蛋白质含量丰富，用黄豆发酵而成的纳豆，蛋白含量几乎与牛肉相当[6]。5种纳豆菌发酵纳豆黏液总蛋白含量测定结果见图2。

图2 不同菌种对纳豆黏液性蛋白质含量影响Fig.2 Effect of different strains on protein contents in natto mucus

由图2可知，菌株JLGZL-018发酵纳豆黏液中总蛋白含量最高，达到（17.38±0.54）%，并与其他4株纳豆黏液差异显著（P＜0.05）；JLLY-214和JLTH-157纳豆黏液蛋白含量分别为（13.68±0.20）%、（13.86±0.28）%，两者之间差异不显著（P＞0.05）；菌株JLCC-243和JLTH-075黏液总蛋白含量较低，分别为（9.57±0.38）%和（9.66±0.77）%，与其他3株菌黏液蛋白含量差异显著（P＜0.05）。纳豆黏液中的总蛋白是由纳豆菌产生的丰富蛋白酶对黄豆蛋白分解产生的多肽、氨基酸等分子质量较小的含氮化合物，该类化合物有利于NK合成，提高纳豆的品质。由于5株菌在发酵过程中产生的蛋白酶种类或者活性不同，所以纳豆黏液中总蛋白存在差异。同时5株菌黏液蛋白含量高低与其对应的活菌数、NK活力趋势基本一致。从黏液蛋白含量来看菌株JLGZL-018生产的纳豆黏液中蛋白总量丰富、品质较高。

2.3.2 不同菌种对纳豆黏液可溶性总糖含量影响

5种纳豆菌发酵纳豆黏液可溶性总糖含量测定结果见图3。

纳豆黏液中的可溶性总糖是纳豆菌产生的淀粉酶、糖化酶等分解黄豆中化合物生成的。黏液中的总糖含量高，则黏液产率较高、纳豆细腻绵软，营养成分更易被吸收利用，纳豆品质好。由图3可知，5株生产的菌纳豆黏液中可溶性总糖不相同，菌株JLGZL-018纳豆黏液中可溶性总糖含量最高，为（5.21±0.13）%。并且在黏液产率、NK活力方面也均优于其他菌株，进一步说明该菌株活力好，分泌的酶能更好的把黄豆中的大分子碳水化合物降解、合成为黏液中的小分子可溶性总糖，其生产的纳豆营养价值较高。

图3 不同菌种对纳豆黏液可溶性总糖量影响Fig.3 Effect of different strains on total soluble sugar contents in natto mucus

2.3.3 不同菌种对纳豆黏液菌株水解氨基酸含量影响

黏液中氨基酸主要来源于纳豆菌生产的蛋白酶对大豆蛋白的分解产物[23]。纳豆中总氨基酸含量是判断纳豆发酵是否成功一个重要指标，也是纳豆苦氨味的来源，黏液中含有大量氨基酸，所以分析其总氨基酸含量显得十分重要[6]。不同纳豆菌发酵纳豆黏液水解氨基酸含量测定结果见表2。

表2 不同菌种对纳豆黏液水解氨基酸含量影响Table 2 Effect of different strains on hydrolyzed amino acids contents in natto mucus g/100 g

由表2可知，纳豆黏液中水解氨基酸含量丰富，16种氨基酸总量为（4.80±0.50）～（5.42±0.40）g/100 g，5株菌氨基酸总量之间差异不显著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高为（5.42±0.40）g/100 g，可能会产生较重的纳豆苦氨味，JLGZL-018菌株氨基酸总量适中，为（5.34±0.27）g/100 g，7种人体必需氨基酸最高为（0.87±0.08）g/100 g，其中蛋氨酸和赖氨酸这两种限制性氨基酸，含量最高分别为（0.03±0.01）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g，说明该菌株生产的纳豆营养成分更理想。谷氨酸不但是重要的呈味物质，也是纳豆黏液拉丝重要组成部分γ-多聚谷氨酸的合成前体，谷氨酸含量高，纳豆黏液丰富、拉丝好、纳豆风味浓郁[13-14]。5株不同菌种发酵的纳豆黏液中谷氨酸含量为（0.51±0.15）～（0.64±0.17）g/100 g，之间差异不显著（P＞0.05），以菌株JLTH-157含量最高为（0.64±0.17）g/100 g优于其他菌株。综合水解氨基酸各指标来看，菌株JLGZL-018最具优势，尤其是限制性氨基酸含量丰富。

2.3.4 不同菌种对纳豆黏液游离氨基酸含量影响

研究表明，黄豆在发酵过程中，黄豆蛋白在微生物的作用下被分解成水溶性氮化物，其中游离氨基酸占水溶性氮化合物的10%[24]。因为游离氨基酸易被降解为对人体有害的生物胺[5，25]，并且其含量与纳豆风味呈负相关，纳豆产品中应控制游离氨基酸含量在适当的范围，是纳豆发酵工艺和产品质量控制的关键指标。不同菌种发酵纳豆黏液游离氨基酸的含量测定结果见表3。

表3 不同菌种对纳豆黏液游离氨基酸含量影响Table 3 Effect of different strains on free amino acid contents in natto mucus mg/g

由表3可知，从游离氨基酸种类及含量来看，5株菌差异不明显。纳豆黏液中游离氨基酸，总量为（3.10±0.09）～（3.36±0.10）mg/g，差异不显著（P＞0.05），菌株JLGZL-018游离氨基酸总量最高为（3.36±0.10）mg/g；7种人体必需氨基酸总量为（1.83±0.05）～（2.02±0.19）mg/g，差异不显著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高为（2.02±0.19）mg/g；5株菌纳豆黏液中谷氨酸含量为（0.11±0.03）～（0.12±0.02）mg/g，差异不显著（P＞0.05），菌株JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214谷氨酸含量最高为（0.12±0.02）mg/g。结果表明，5株菌之间各有特点，性能差别不是很大。

3 结论

综上所述，菌种来源不同，生产的纳豆NK活力和黏液营养成分各方面有所差异。其中菌株JLGZL-018生产的纳豆NK活力最高为4 167 IU/g，属于NK高产菌株。黏液产率最高为（22.66±2.61）%；黏液中总蛋白、可溶性糖，含量最高分别为（17.38±0.54）%、（4.80±0.50）%；黏液中水解氨基酸中的必需氨基酸、限制性蛋氨酸、赖氨酸含量分别为（0.87±0.08）g/100 g、（0.03±0.00）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g均高于其他4株菌；在与纳豆风味呈负相关的游离氨基酸含量方面，与其他菌株差别不明显。综合来看，JLGZL-018菌株无论是在NK活力实验，还是黏液营养成分方面均具有明显优势，而且发酵性能较好，具有开发应用潜力，本研究可为高品质纳豆生产用菌筛选提供依据。