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响应面法优化女贞叶中三萜类成分的提取工艺

2019-10-28严小童冯承涛

安徽科技学院学报 2019年4期
关键词:三萜类叶中女贞

严小童, 冯承涛

(安徽理工大学 化学工程学院,安徽 淮南 232000)

研究表明,三萜类化合物具有溶血、抗癌、解热、抗炎、镇痛、抗菌抗病毒等多种治疗作用[1-2],但三萜类化合物难溶于水,提取工艺有待优化。β-环糊精是一种具有特殊的呈闭合圆筒状无臭,微甜,无毒的白色结晶粉末。其外表面是亲水性的,内部则是疏水性的管腔,其空间能包合住适当大小的药物分子,形成的包合物在水中有较大的水溶性,从而增加药物的溶解度,改变药物的特性[3-4]。β-环糊精分子可以与三萜类物质的分子形成可溶于水的复合物,利用β-环糊精能够有效的增大三萜类物质的提取率。本文应用响应面法研究在不同因素下β-环糊精对女贞叶中三萜成分提取的辅助作用,以确定其最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 供试材料

女贞叶购于亳州中药材大市场,经安徽科技学院中药教研室毛斌斌老师鉴定为为木犀科女贞属植物女贞(LigustrumlucidumAit.)的叶;BSA124S电子分析天平(赛多利斯有限公司);UV-650型紫外分光光度计上海美谱达有限公司);齐墩果酸对照品(纯度98%,安徽酷尔生物工程有限公司);其他试剂均为分析纯,购于国药试剂公司。

1.2 实验方法

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 齐墩果酸最大吸收波长的确定和标准曲线的绘制 精密称取齐墩果酸标准品5.0 mg用甲醇溶解,置25 mL容量瓶中定容。分别吸取齐墩果酸对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分别置于10 mL具塞试管中,90 ℃水浴挥干溶剂后,加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,60 ℃ 恒温水浴显色15 min后冷却5 min,加冰醋酸稀释至刻度,摇匀,用相同方法处理的溶液作为空白对照,用紫外分光光光度计测吸光度确定最大波长,并绘制标准曲线。

1.3.2 女贞叶中三萜成分的提取与测定 取2 g干燥女贞叶粗粉和2 g β-环糊精置于100 mL具塞三角锥形瓶中,量取无水乙醇溶液30 mL,称定重量,40 ℃下超声处理1 h,摇匀底液,趁热抽滤,将获得滤液在80 ℃水浴锅中蒸干挥发乙醇得浸膏,用适量甲醇溶解浸膏得均匀溶液,精密量取一定量的滤液进行稀释,加入适当显色剂在最大吸收波长处测吸光度。根据标准曲线回归方程测定滤液中的三萜成分质量浓度(C),计算三萜成分的提取率。

三萜成分的提取率 (mg/g)=C×n×V/M

其中式中C(mg/mL)为三萜成分的质量浓度,n为滤液稀释倍数,V(mL)为滤液体积,M(g)为供试女贞子粉末质量。

1.3.3 单因素实验考察设计 分别考察溶剂比(80%、75%、70%、65%、60% )、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、提取温度(20、30、40、50、60 ℃)以及试样量与β-环糊精之比(1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5)5个因素对三萜提取率的影响[8],其中将β-环糊精作为一个因素探究其对三萜提取率的综合影响,最后根据对提取的率的影响程度,选取四个显著因素进行响应面分析[5-6]。

1.3.4 响应面法优化实验设计 单因素试验筛选出了作用最为显著的四组,即溶剂比、料液比、提取温度以及β-环糊精用量为自变量,女贞叶中三萜的提取率为响应值,运用Design Expert 10.0软件进行响应面分析。同时考察了溶剂比、料液比、提取温度以及试样量与β-环糊精之比交互作用对于女贞子三萜成分提取率的影响,并且建立各因素与提取率之间的数学模型[7-8],实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长及标准曲线

以齐墩果酸为指标化合物,经紫外最大波长扫描,确定其最大吸收波长为540 nm 。在540 nm处测各浓度梯度标准品的吸光度,以质量浓度c(mg/mL)与吸光度值A建立回归方程:A=57.727c-0.037 4,相关系数为0.996 0,线性范围为0.003~0.015 mg/mL,其标准曲线详见图1。

图1 齐墩果酸标准曲线

图2 乙醇浓度对提取率的影响

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响 如图2,乙醇体积分数在60%~75%范围内,随着乙醇浓度的增加,女贞叶中三萜成分的提取率呈现增长趋势;在75%时达到最大值为3.82 mg/g,当大于75%时三萜提取率则逐渐降低,因此可见在乙醇浓度控制在75%时最为合适。

2.1.2 料液比对提取率的影响 如图3所示,料液比控制在1∶10~1∶25范围内时,随着料液比不断增加,三萜成分的提取率呈现增长的趋势;在1∶40时达到最大值,三萜成分的提取率达到最大为3.68 mg/g;当料液比超过1∶25时,三萜成分的提取率开始逐渐降低,因此控制料液比在1∶25左右合适。

图3 料液比对提取率的影响

图4 试样量与β-环糊精之比对提取率的影响

2.1.3 β-环糊精对提取率影响 如图4所示,当试样量与β-环糊精之比在1∶0.5~1∶1.5范围内,随着β-环糊精量的增加,三萜成分的提取率呈现增长的趋势;当试样量与β-环糊精的量之比为1∶1.5时,三萜成分的提取率达到最大,为4.23 mg/g;当试样量与β-环糊精之比大于1∶1.5时,三萜成分的提取率开始逐渐降低,因此试样量与β-环糊精之比选择1∶1.5比较合适。

2.1.4 提取温度对提取率的影响 如图5所示,提取温度在20~50 ℃范围内时,提取率随温度的升高而升高;当提取温度在50 ℃时提取率达到最大,为3.66 mg/g;当提取温度超过50 ℃后,温度升高,提取率下降,则最适宜的提取温度为50 ℃。

图5 提取温度对提取率的影响

2.1.5 提取时间对提取率的影响 如图6所示,提取率随提取时间的变化而变化,当提取时间为50 min时,提取率达到最大值3.63 mg/g。

图6 提取时间对提取率的影响

2.1.6 综合分析各因素对提取率的影响 通过单因素试验综合分析,可知β-环糊精的量对提取率的影响最为显著,同时在实验过程中可以观察到β-环糊精大大提高了女贞叶中有效成分在甲醇中的溶解度,增大了其溶解的速率,缩短了所需溶解的时间;同时在5个因素中提取的时间对其提取率的影响不大可忽略。综合各因素的影响效果可筛选出溶剂比,料液比,试样量与β-环糊精之比和提取温度4个因素对提取率的影响最为显著,可以作为自变量进行响应面法分析。

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面法优化实验的结果与分析 根据响应面法实验设计,超声提取女贞子中三萜成分的提取率见下表2:

采用Design Expert 10.0软件对上表中的数据进行多元线性回归和二次多项方程拟合[9],所得女贞叶三萜成分的提取率与溶剂比(A)、料液比(B)、提取温度(C)、试样量与β-环糊精之比(D)二次多项回归方程y=5.01+0.10×A+0.21×B+0.29×C+0.21×D-0.083×A×B+0.23×A×C+5.750-E003×A×D-0.20×B×C+0.11×B×D-0.13×C×D-0.60×A2-0.67×B2-0.33×C2-0.80×D2。如上所示,该回归方程拟合效果好,失拟性不显著,能很好地反映各因素对女贞叶中三萜类化合物提取率的影响。

表2 女贞子中三萜成分提取的响应面法优化实验结果

表3 女贞叶三萜提取工艺响应面回归方程系数的方差分析

注:“*”表示显著;“**”表示不显著

模型中F=9.93,P<0.000 1,表明实验所采用的二次模型是极其显著的,在统计学上是非常有意义的。说明未知因素干扰极小,因此F值是可靠的。回归方程的决定系数R2值为0.908 5,说明有90.85%的相关性与自变量 三萜的提取率有关,所以该回归方程能够很好地说明各因素与响应值之间的关系,且同时有具体的数值大小进行反映。则可以用此模型对女贞子中三萜类提取实验的结果进行预测和分析。

3 结论与讨论

本次试验利用超声波提取法提取女贞叶中的三萜成分,探究β-环糊精对三萜成分的提取增溶作用以及最佳作用条件,首先将β-环糊精作为一个因素和其他因素一起进行单因素实验。筛选影响效果最显著的4组通过响应面分析法对女贞叶中三萜成分的工艺进行优化,通过四因素三水平建立单因素与响应值间的数学模型,研究结果表明最佳提取工艺条件为溶剂比为75%、料液比1∶25、试样量与β-环糊精之比为1∶1.5 、提取温度55 ℃,最佳提取率为5.115 30 mg/g,与预测值相差较小,因此可以得出β-环糊精能够大大提高女贞叶中三萜的提取率,为今后三萜的工艺大量生产提供了有力的依据。女贞叶中三萜提取工艺多以齐墩果酸为评价指标,已有部分研究是关于相应面优化女贞叶中有效成分的提取工艺,但对于本实验研究的β-环糊精对三萜成分的辅助提取作用研究工艺尚未见有所报道,本实验采用的响应面法,避免了正交实验的各种缺点,使优化结果的数据更加精确。

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