HPLC法检测格列齐特中的杂质B及不同溶剂的影响结果

范婷婷 汪嘉丽（通讯作者）

（常州市食品药品监督检验中心 江苏 常州 213000）

《中国药典》2015年版二部[1]已收载格列齐特的有关物质方法，但未收载杂质B的检测方法，杂质B生物活性及毒理作用尚未查到相关报道，但作为格列齐特的合成中间体也要进行必要的控制。本实验建立了对格列齐特原料药中杂质B的定量检测方法及各溶剂对杂质B检出的影响，对进一步研究格列齐特及其它杂质起到借鉴作用。

1.实验部分

仪器：岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配有SPD-M30A高灵敏度检测器；XP205电子天平（Mettler-Toledo公司）

试剂：甲醇（色谱纯，赛默飞公司）；乙腈（色谱纯，赛默飞公司）；二甲亚砜（色谱纯，赛默飞公司）；超纯水（Milli-Q制备）；格列齐特杂质B（批号：180415-01-ZYL）；三氟乙酸（阿拉丁）三乙胺（国药集团化学试剂有限公司）。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Luna 5µm C8(2)100A LC Column 250×4.6mm；流动相：乙腈- [三氟乙酸-三乙胺-水（1:1:55）]（35:65）；流速：1.2ml/min；柱温：35℃；检测波长：235nm；进样量：20µl。

2.2 供试品溶液的制备

取本品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加2.5ml DMSO使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，在4℃环境中冷却30分钟，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以乙腈-水和甲醇-水作为供试品配制方法同上。

2.3 对照品溶液的制备

取杂质B对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加DMSO使溶解并稀释至刻度，精取1ml至50ml量瓶中，加入12ml DMSO并用水稀释至刻度，再精取1ml置100ml量瓶中，加入24ml DMSO并用水稀释至刻度，即得。以乙腈-水和甲醇-水作为对照品溶液配制方法同上。

2.4 线性

将浓度为0.08ug/ml、0.016ug/ml、0.032ug/ml、0.04ug/ml、0.08ug/ml的标准溶液，在选定的液相条件下进样测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，得到杂质B的浓度与峰面积的线性回归方程以不同溶剂溶解分别为y=1E+06x+2754.7[R2=0.9997，DMSO-水(24:76)]；y=1,424,735.7724x-631.6992[R2=0.9990，乙腈-水(24:76)]；y=1,235,124.9121x-986.52[R2=0.9982，甲醇-水(24:76)]。可见以DMSO-水做溶剂时线性最好，可进行定量计算。

2.5 以DMSO-水为溶剂的检测方法的精密度、准确度、检出限

精密度：对浓度分别为0.008ug/mL、0.032ug/mL和0.08ug/mL的杂质B重复测定6次，根据数据结果，计算相对标准偏差。考察分析方法的精密度，见表1。结果表明，所有浓度梯度的相对标准偏差≤1.0%。满足定量计算要求。

准确度：精密称取未检出杂质B的阴性样品50mg，分别加入0.08ug/mL浓度的杂质B标准溶液4.0mL(6.4ppm)、5.0mL(8.0ppm)和6.0mL(9.6ppm)各三份并定容至10mL，以相同的操作条件，重复测定6次对其定量分析并计算样品的回收率。结果见表2，范围为99.1%～99.8%，表明所建立的分析方法得到的测定结果准确，可靠。

检出限：在相同的色谱条件下，杂质B的检出限（LOD）为0.64ppm(S/N=3)；定量限（LOQ）为1.6ppm(S/N=10)。

表1 杂质B检测方法的精密度

表2 杂质B检测方法的准确度

2.6 以DMSO-水为溶剂的溶液的稳定性

取本品以DMSO-水为溶剂的对照品溶液，于室温下放置0,2,4,6,8,10,12h，进样并记录色谱图。结果杂质B的峰面积RSD为1.21%（n=5）。表明对照品溶液在12小时内稳定。

3.讨论

综上所述，首先本实验建立了格列齐特杂质B的微量检出方法，该方法简便、快捷、准确，增强了高效液相法检测微量杂质的灵敏度；其次，在本方法的基础上考察了三种不同溶剂对杂质B的影响，结果是以甲醇-水和乙腈-水作为溶剂时，线性与分离效果都没有以DMSO-水作为溶剂时理想，可进行进一步研究；最后，应用本方法并以DMSO-水作为溶剂时线性及回收率良好，稳定性强，可用于格列齐特中杂质B的定量检测。