细针穿刺检测Galectin-3和CK19在甲状腺滤泡状肿瘤中的表达差异

范晓峰 胡蓉菲 朱 婷 车 欣 伍 珑

甲状腺结节临床常见，1%～5%的人群体检可触及结节，高分辨超声检查获得的甲状腺结节的发生率为19%～68%，而甲状腺结节中甲状腺癌的发生率为7%～15%[1]。目前细针穿刺抽吸活检(fine needle aspiration biopsy，FNAB)是评估甲状腺结节良、恶性敏感度和特异性最高的方法，与触诊下FNAB比较，超声引导下FNAB的取材成功率和诊断正确率更高[2～4]。然而FNAB鉴别甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)的诊断价值不大，尤其是微小浸润型滤泡状癌和滤泡性腺瘤(thyroid follicular adenoma,FA)之间难以鉴别，因为滤泡状肿瘤良、恶性的区别在于肿瘤是否侵犯包膜和血管，而FNAB即使是多点取材也不除外遗漏上述病变，造成恶性肿瘤的误诊、漏诊，故为提高甲状腺滤泡状癌的早期筛查的准确性，临床可考虑其他方法加以辅助。肿瘤标志物是目前甲状腺癌诊疗的热门方法之一，其中Galectin-3和CK19是两种在甲状腺良、恶性肿瘤中具有明显差异表达的肿瘤标志物[5～7]，可作为判断肿瘤良、恶性的指标之一，但目前FNAB联合肿瘤标志物是否可以提高甲状腺恶性肿瘤的术前诊断率的研究鲜有报道。故本研究通过分析FNAB的细胞学特点及Galectin-3和CK19的表达情况，探讨其联合诊断对甲状腺滤泡状良、恶性肿瘤的鉴别诊断价值，以期提高术前诊断率，减少不必要的手术及避免遗漏恶性病变。

资料与方法

1.一般资料：选取2013年1月～2017年12月来笔者医院就诊并经手术治疗的甲状腺肿瘤患者392例，并从中筛选出术后病理证实为甲状腺滤泡状癌的患者36例(共40个结节)，分为FTC组，甲状腺滤泡性腺瘤患者47例(共53个结节)，分为FA组。FTC组男性7例，女性29例，患者年龄26～73岁，平均年龄49.31±10.26岁。FA组男性17例，女性30例，患者年龄24～74岁，平均年龄46.35±8.65岁。两组病例均符合以下要求：①术前均已行细针穿刺抽吸活检，穿刺指征符合2012年《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[8]；穿刺标本完整，可行Galectin-3和CK19表达的检测；②术后病理诊断符合WHO关于甲状腺结节的组织病理学分型，并进行了Galectin-3和CK19表达的检测；③所有患者均为首次确诊并首次行切除手术；④未合并其他肿瘤；术前未行放、化疗及内分泌治疗；⑤病历资料完整。所有患者均签署知情同意书，手术通过笔者医院伦理学委员会批准。

2.细针穿刺抽吸活检：患者仰卧，颈部垫高过伸以充分暴露甲状腺，经通用电气公司LOGIQ7或飞利浦EPIQ5确定甲状腺结节穿刺部位后，嘱患者头偏向非穿刺侧，局部消毒(必要时局部麻醉)，超声引导下25号穿刺针接10ml注射器以约45°进针，在结节内重复提插注射器针栓数次完成取材，将穿刺物进行涂片、甲醛溶液固定，即刻送病理科行Galectin-3和CK19检测。

3.免疫组化染色及结果判读：组织经石蜡包埋、切片、水化后使用免疫组化SP法行Galectin-3和CK19染色标记，鼠抗人CK19抗体和Galectin-3单克隆抗体均购自上海我武生物科技有限公司，以细胞质、细胞膜、细胞核出现棕黄色颗粒并明显高于背景着色为阳性结果，各指标的免疫组化染色结果均采用半定量计数法进行分析，即阳性细胞的百分率与阳性细胞染色强度的乘积[9]：(1)阳性细胞所占的百分比：没有阳性细胞为0分；阳性细胞>0且≤10%为1分；>10%且≤50%为2分；>50%且≤80%为3分；>80%为4分。(2)细胞染色强度按阴性、弱、中、强分别给予0～3分，最终得分0分为阴性，1～2分为(+)，3～6分为(++)，7～12分为(+++)。所有检查均经两位副高级职称病理科医生独立确认。

4.统计学方法：采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，由于两组样本分别来自除总体均值以外完全相同的两个总体，故采用Mann-Whitney秩和检验对FTC组和FA组的FNAC标本所检测的Galectin-3和CK19表达情况进行比较，分别计算两样本的准确性、敏感度等指标，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.镜检及免疫组化结果：36例甲状腺滤泡状癌的标本经术后常规病理检查可见滤泡由形态一致的细胞构成，其内含有胶质，部分癌细胞分化不明显，而且存在无胶体的有巢细胞，无乳头状结构，可见包膜和(或)血管侵犯。47例滤泡性腺瘤常规病理检查可见含胶质的形态均匀的滤泡，核分裂像少见，无明显异型性，包膜及滤泡结构完整，无血管浸润。免疫组化显示Galectin-3主要在细胞质表达，大部分为中等或较强阳性，部分细胞核、细胞膜也可见阳性表达。CK19主要在细胞质中着色，呈中等强度阳性(图1)。在FNAB中也可见滤泡样肿瘤改变及上述两种肿瘤标志物表达，但并不能确定是否存在血管或包膜浸润(图2)。

图1 术后病理组织Galectin-3和CK19的表达(IHC,×200)A.滤泡性癌CK19;B.滤泡性癌Galectin-3；C.滤泡性腺瘤CK19；D.滤泡性腺瘤Galectin-3

图2 FNAB所见Galectin-3和CK19的表达(IHC,×200)A.CK19；B.CK19；C.Galectin-3；D.Galectin-3

2.Galectin-3和CK19在甲状腺滤泡型肿瘤中的表达:通过Mann-Whitney检验对比FTC组和FA组中Galectin-3和CK19的表达情况(表1)，可知Galectin-3在FTC组和FA组中的表达分别为80.6%(29/36)和27.7%(13/47)，Galectin-3在FA组没有强阳性的表达，两组间比较差异有统计学意义(Z=25.786，P<0.05)。CK19在FTC组和FA组中的表达分别为86.1%(31/36)和34.0%(16/47),在FA 组未见强阳性的表达，两组间比较差异有统计学意义(Z=24.882，P<0.05)。

表1 Galectin-3和CK19在FTC组和FA组的表达情况

3.Galectin-3和CK19诊断滤泡性癌的敏感度、特异性与准确性:Galectin-3在鉴别甲状腺滤泡状癌和滤泡性腺瘤时的敏感度为82.5%，特异性为88.7%，准确性为86.0%，阳性预测值为84.6%，阳性预测值为87.0%(表2)。CK19在鉴别甲状腺滤泡状癌和滤泡性腺瘤时的敏感度为87.5%，特异性为79.2%，准确性为82.8%，阳性预测值为76.1%，阴性预测值为89.4%(表3)。CK19 的敏感度高而Galectin-3的特异性高。

表2 FNAB与病理组织检测Galectin-3的表达情况

表3 FNAB与病理组织检测CK19 的表达情况

讨 论

甲状腺癌已成为影响人们生活与健康的一大类疾病，目前各个国家甲状腺癌的发生率正逐年增长，在韩国其发生率已攀升至女性恶性肿瘤的首位，在国内甲状腺癌发生率已在女性恶性肿瘤发生率中位居前列[10，11]。若能在40岁以前确诊，患者5年和10年疾病相关生存率可分别达到95%和75%，而40岁以后确诊的生存率仅为65%和60%[12]。故尽早将少数原发性甲状腺癌从众多的良性结节中鉴别出来，并对其进行分期、预测侵袭性和随访，对制定治疗方案和改善预后均具有重大意义。

甲状腺滤泡状癌发生率位居甲状腺恶性肿瘤的第2位，且常见血管侵犯，通过血行转移至骨、肺等其他部位，侵袭程度越重，播散距离越远，则预后越差。近年来，部分研究发现甲状腺滤泡腺瘤和滤泡癌中高频率的突变表明两者之间存在某种关联，镜检下鉴别两者要求肿瘤包膜全部取材才能明确是否存在包膜或血管侵犯，但取材、切片等因素仍可影响误诊、漏诊，即使全部取材也不能代表看到标本的全部切面。故近期的多项研究开始以肿瘤标志物为对象，试图通过增加肿瘤标志物的检测以期提高诊断率。CK19作为一种细胞角蛋白，对上皮细胞起到一定维护作用，以保证上皮细胞整齐连续，与上皮细胞增长分裂密不可分。本研究36例FTC患者中共送检甲状腺结节标本40个，其中两例患者分别检出1个CK19阳性结节和1个CK19阴性结节，在FTC组呈中等强度阳性，在FA组有弱阳性表达，但66.0%(31/47)呈阴性表达，整体诊断敏感度为87.5%，特异性为79.2%，与贾丽琼等[13]结果相近，提示CK19作为甲状腺滤泡性肿瘤的标志物对于区分其良、恶性病变有一定的帮助，但其特异性和阳性预测值均较低，单独CK19可能难以判断标本为甲状腺滤泡状癌。

Galectin-3是一种半乳糖蛋白，生理作用下在机体内参与调节细胞增殖、黏附和凋亡[14]。此外，有研究证实Galectin-3 在多种类型恶性肿瘤中出现高水平表达，认为其可能作为主要蛋白直接参与了肿瘤进展[15]。近年来研究显示Galectin-3在甲状腺恶性肿瘤中的表达率明显高于良性肿瘤[16]。本研究也表明，Galectin-3在FTC组和FA组中的表达存在明显差异(P<0.05)，阳性预测值(84.6%)及准确性(86.0%)均较高，且其在FTC组的表达率与近期其他小样本的研究结果相近，进一步增强了说服力，增加了甲状腺滤泡性肿瘤标志物研究的统计样本量，利于今后的Meta分析，不过仍有14例表达为弱阳性，呈强阳性表达的例数较少，单独对比一个细针穿刺抽吸活检的FTC标本有时难以与FA区分，在检测Galectin-3时仍需进一步比较FTC和FA染色的情况。

目前虽有研究提示肿瘤标志物一定程度上可提高甲状腺良、恶性滤泡性肿瘤的鉴别能力，但尚无充足的循证医学证据证明其在大范围人群中诊断的可靠性，且也没有统一和固定的肿瘤标志物用于甲状腺疾病的诊断。本研究纳入病例数量较少，对于Galectin-3和CK19在FTC诊断中的比较尚不全面，未深入探讨其在甲状腺良、恶性肿瘤中的表达机制，尚需要更多的临床数据及分子水平的研究。

综上所述，超声引导下穿刺细胞检查的同时完善Galectin-3和CK19等免疫组化的检查，可一定程度上协助临床医生诊断良、恶性甲状腺滤泡状肿瘤。