苦豆碱对肾癌A498细胞的体外杀伤作用研究

李 明 秦 聪

在过去10年里，肾癌发展为第7大常见肿瘤，而且确诊时，大约30%的患者已经发生远处转移[1]。对于进展性肾癌，免疫治疗或分子靶向治疗可以一定程度上改善患者的生存率，但其细胞毒性却不可避免[2，3]。传统中药发展迅速，在减少肿瘤的复发、转移、延长患者的生存时间和提高患者生活质量等方面发挥越来越重要的作用[4]。同时以往研究发现，中药提取物苦豆碱可通过抑制Erk1/2蛋白磷酸化，从而抑制膀胱癌EJ细胞增殖并诱导其凋亡[5]。也有其他研究发现，苦豆碱可以通过抑制Akt和ERK蛋白磷酸化从而抑制前列腺癌细胞增殖，可通过激活caspase-3从而诱导前列腺癌细胞凋亡，可通过p53/p21信号通路诱导前列腺癌细胞周期阻滞，从而抑制前列腺癌细胞的活性[6]。然而，苦豆碱对肾癌细胞的作用目前尚无相关研究，本研究拟通过体外实验观察苦豆碱对肾癌A498细胞的杀伤作用并初步探讨其作用机制。

材料与方法

1.材料：人肾癌A498细胞购于ATCC细胞库，苦豆碱(ab143290)购于英国Abcam公司，细胞凋亡试剂盒购于美国BD公司，Bax(ab32503)一抗购于英国Abcam公司，cleaved caspase-3(#9661)一抗购于美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH(ab181602)一抗购于英国Abcam公司，羊抗兔荧光二抗购于美国LI-COR公司，胎牛血清购于美国Sciencell公司，青霉素-链霉素购于杭州吉诺公司，BPMI-1640培养基购于杭州吉诺公司，胰蛋白酶购于美国Gibco公司。

2.肾癌A498细胞的培养与处理：肾癌A498细胞用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃、5%的CO2培养箱培养、传代。实验分为3组：苦豆碱0mmol/L组、苦豆碱0.2mmol/L组和苦豆碱0.4mmol/L组，通过CCK8法检测各组细胞存活率，通过倒置显微镜观察细胞形态学变化，通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率，通过Western blot法检测各组细胞Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。

3.CCK8法检测各组细胞存活率：在96孔板接种100μl的A498细胞悬液，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养细胞24h。24h后，去除培养液，培养板中每个孔中加入100μl的含有不同浓度苦豆碱的培养液。然后，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养48h。之后，向培养板中每孔加入10μl的CCK8溶液。然后，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱孵育60min。最后，用酶标仪检测各组样品450nm处的吸光度(A)值。

4.倒置显微镜观察细胞形态变化：在6孔板接种相同数量的A498细胞悬液，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养细胞24h。24h后，去除培养液，培养板中每个孔中加入含有不同浓度苦豆碱的培养液。然后，将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱培养48h。最后，倒置显微镜下观察细胞形态改变并拍照。

5.流式细胞术检测细胞凋亡水平：在6孔板接种相同数量的A498细胞悬液，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养细胞24h。然后，去除培养液，培养板中每个孔中加入含有不同浓度苦豆碱的培养液。然后，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养48h。用离心管收集上清液，之后每个孔加入0.5ml胰蛋白酶消化3min，用上清液终止消化并收集全部细胞，然后用离心机离心细胞，取双蒸水将10×Bingding Buffer稀释为1×，取100μl的1×Bingding Buffer将细胞重悬。然后，每管加入5μl的PE、5μl的7-AAD溶液。混匀后，室温避光孵育15min。然后，每孔加入400μl的1×Bingding Buffer。最后，流式上机检测各组细胞凋亡水平。

6.Western blot法检测各组细胞蛋白表达水平：蛋白样品制备：在6孔板接种相同数量的A498细胞悬液，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱培养细胞24h。24h后，去除培养液，培养板中每个孔中加入含有不同浓度苦豆碱的培养液。然后，将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱培养48h。用离心管收集上清液，之后每个孔加入0.5μl胰蛋白酶消化3min，用上清液终止消化并收集全部细胞。加入细胞裂解液冰上裂解细胞5min，用BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液移后至离心管100℃加热10min，使蛋白变性。凝胶的配制：SDS-PAGE凝胶试剂盒购于武汉赛维尔公司，按照说明书配制15ml浓度为12%的分离胶，放置30min，然后配制6ml浓度为5%的浓缩胶，插入梳子放置20min后拔下梳子。蛋白上样与电泳：将提前配制好的电泳液倒入电泳槽中，蛋白样本加入上样孔。电泳时，浓缩胶电压为70V，进入分离胶后电压调至90～100V。溴酚蓝进入底层胶时停止电泳。转膜：切割适当大小的PVDF膜，在甲醇中激活2min，切下胶片，将膜贴在相应分子量位置。转膜电流200mA，冰上进行。转膜时间大约60min。封闭：配制5%脱脂奶粉封闭液，将膜放到TBS溶液中漂洗后，将膜放入封闭液中，摇床上摇动1h。一抗的孵育：Bax(1∶1000)、cleaved caspase-3(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)，用一抗稀释液稀释。取出膜，用TBS清洗2遍，然后，将膜放入相应的一抗溶液中，4℃摇床上过夜。二抗的孵育：将膜取出，用TBS溶液清洗3遍，每遍8min。将膜放到二抗溶液中，摇床上室温避光孵育1h。之后，将条带取出放到TBS溶液中清洗3遍，每遍8min。蛋白检测：通过Odyssey双色红外激光成像系统扫膜，读取灰度值。

结 果

1.CCK8检测结果：苦豆碱0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L组细胞存活率分别为：100%、74%±10%和40%±8%。苦豆碱0.2mmol/L和0.4mmol/L组细胞存活率与苦豆碱0mmol/L组比较，差异有统计学意义(P值分别为0.009和0.000，图1)。而且，苦豆碱0.4mmol/L组细胞存活率与苦豆碱0.2mmol/L组比较，差异有统计学意义(P=0.009，图1)。以上数据表明，苦豆碱0.2mmol/L和0.4mmol/L可明显抑制A498细胞增殖，且呈剂量效应。

图1 各组细胞存活率不同浓度的苦豆碱(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498细胞48h后各组细胞存活率。与0mmol/L组比较，*P<0.05；与0.2mmol/L组比较，#P<0.05

2.倒置显微镜观察结果：苦豆碱0mmol/L组中细胞充满活力，平铺排列有序，细胞凋亡数量极少。苦豆碱0.2mmol/L、0.4mmol/L组，细胞数量减少，大量细胞变圆，漂浮细胞数量增加，细胞凋亡明显，且随着苦豆碱浓度升高，细胞凋亡数量增加(图2)。苦豆碱浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L可以促进A498细胞凋亡，且呈剂量效应。

3.流式细胞术检测结果：苦豆碱0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L组细胞凋亡率分别是：5.23%、33.10%和51.50%，苦豆碱0.2mmol/L、0.4mmol/L组与苦豆碱0mmol/L组比较，细胞凋亡率明显增加，且呈剂量效应(图3)。苦豆碱0.2mmol/L、0.4mmol/L可使A498细胞凋亡率增加，且呈剂量效应。

图2 各组细胞形态学变化(×100)不同浓度的苦豆碱(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498细胞48h后明场下细胞形态的变化;A.0mmol/L;B.0.2mmol/L;C.0.4mmol/L

图3 各组细胞凋亡率不同浓度的苦豆碱(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入A498细胞48h后细胞凋亡率的变化;A.0mmol/L;B.0.2mmol/L;C.0.4mmol/L

4.Western blot法检测结果：苦豆碱0.2mmol/L和0.4mmol/L组较苦豆碱0mmol/L组的Bax和cleaved caspase-3蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义(Bax蛋白P值分别为0.001和0.000；cleaved caspase-3蛋白P值分别为0.001和0.000，图4)。而且，苦豆碱0.4mmol/L组较苦豆碱0.2mmol/L组Bax和cleaved caspase-3蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义(Bax蛋白P=0.001；cleaved caspase-3蛋白P=0.002，图4)。苦豆碱浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L可促进A498细胞Bax和cleaved caspase-3蛋白表达，且呈剂量效应。

图4 凋亡蛋白表达量变化不同浓度的苦豆碱(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L)加入到A498细胞48h后凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表达量的变化。与0mmol/L组比较，*P<0.05；与0.2mmol/L组比较，#P<0.05

讨 论

目前临床治疗肾癌的化疗药物有多种，然而肾癌的存活率和复发率仍堪忧[7]。同时，在抗肾癌治疗过程中，目前常用化疗药物的不良反应和耐药性也是一个难题。因此，从天然植物中提取具有抗肿瘤活性的化合物也是抗肿瘤治疗的有效途径之一。

苦豆碱是从药用植物苦豆子中提取的一种生物碱，研究表明苦豆碱具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒和抗氧化等作用[8～12]。也有研究发现，苦豆碱具有血管舒张作用，苦豆碱可以改善实验性蛛网膜下腔出血后的脑损伤[13,14]。苦豆碱对野百合碱诱导的肺动脉高压具有保护作用，苦豆碱也可以抑制异丙肾上腺素诱导大鼠心脏肥厚[15,16]。在小鼠肺纤维化模型中，苦豆碱可以抑制成纤维细胞增殖和分化，进而抑制博来霉素诱导的肺纤维化[17]。目前，多项研究已证实了苦豆碱抑制肿瘤活性方面的作用。Tian等[9]研究发现，苦豆碱可阻断Ras信号通路，抑制Raf1和Erk1/2的磷酸化，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡。苦豆碱可以抑制PI3K/AKT信号通路，诱导骨肉瘤细胞凋亡，并抑制其侵袭[10]。而且，苦豆碱可通过诱导细胞发生G2/M周期停滞以及激活线粒体死亡途径发挥抗结肠癌细胞增殖的作用。然而，苦豆碱在肾癌细胞中的作用及机制尚无相关研究，本实验笔者首次证实了传统中药提取物——苦豆碱的体外抗肾癌作用。

本实验发现，0.2mmol/L的苦豆碱作用于肾癌A498细胞后，细胞形态发生变化，细胞变圆，细胞出现漂浮，细胞生长受到抑制，并且随着苦豆碱浓度升高，在0.4mmol/L浓度时，漂浮细胞数量明显增多，细胞质内出现空泡变性，细胞凋亡数量大大增加，表明苦豆碱在一定浓度下可以抑制A498细胞增殖并诱导其凋亡，并呈现出明显的剂量效应。

同时，笔者用流式细胞术检测不同浓度苦豆碱作用于肾癌A498细胞后的细胞凋亡情况，发现随着苦豆碱浓度的升高，细胞凋亡数量明显增多，凋亡率明显升高。Western blot法检测的Bax和cleaved caspase-3蛋白表达量也随着苦豆碱浓度的升高而增加。以上结果表明，体外实验中一定浓度的苦豆碱能够诱导肾癌A498细胞凋亡，且随着药物浓度的增加，诱导凋亡的效应更加明显。这一结果与上述细胞形态学的检测结果一致，也与其他研究者发现的苦豆碱可抑制乳腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌等多种癌细胞株增殖并促进细胞凋亡的结果相似。

综上所述，体外实验中苦豆碱对肾癌A498细胞具有较好杀伤作用，苦豆碱可以抑制肾癌A498细胞的增殖，并增加Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达，从而促进肾癌细胞凋亡。本实验中苦豆碱对肾癌A498细胞的作用效果显著，将来有望成为新的抗肾癌药物。