槟榔芋软腐病土壤拮抗细菌的筛选

董晓菲 史辉 赖倩玉

摘要：为对槟榔芋软腐病进行生物防治，从槟榔芋根际土壤分离出53株细菌，经离体球茎拮抗筛选，获得9株对槟榔芋软腐病具有拮抗效果的细菌。拮抗菌的拮抗机制分析表明，拮抗菌对病原菌的拮抗作用不是由于产生次生抑菌物质引起的，这种拮抗方式不会引起病原菌的耐药性突变，因此更为安全可行。

关键词：槟榔芋;软腐病;生物防治;土壤拮抗细菌;拮抗方式

中图分类号： S436.32  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0135-02

檳榔芋（Colocasia esculenta L.var.cormosus Chang），属于天南星科芋属魁芋类。槟榔芋有较高的经济价值，在福建省福鼎地区大面积种植[1]。软腐病是槟榔芋最重要的病害之一，该病病原为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病型（Erwinia carotovora subsp. carotovora），属细菌[2]。此病菌也是主要引起其近缘物种芋头[3]、魔芋[4-5]软腐病的主要病菌。近年来发生危害日益严重，给槟榔芋产业造成了严重威胁，传统的防治方法有药剂防治、合理密植和轮作等[6]，但效果均不理想且存在食品安全和生态环境问题。

研究表明，土壤微生态环境恶化是造成许多作物重茬病的主要原因。因此，从调控土壤微生态环境入手，利用植物根际土壤微生物对槟榔芋病害进行生物防治既可达到病害防治的目的，又可保持生态平衡，降低化学农药造成的环境污染，是一种很有研究前景的控制措施。相关学者对苹果、番茄、柑橘、草莓、葡萄、辣椒等果蔬的采前、采后病害进行了微生物防治的研究，也取得较好效果。但国内外尚无槟榔芋软腐病生物防治方面的的报道。本研究在实验室前期已经分离鉴定了槟榔芋软腐病病原菌的基础上，对槟榔芋根系土壤微生物进行拮抗菌株的筛选，以期为槟榔芋软腐病的防治和生防菌株的开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 土样采自福建省福鼎市贯岭镇河坑村槟榔芋种植田地。取深度10～15 cm的健康槟榔芋植株根际土壤200 g带回实验室，备用。槟榔芋软腐病病原菌为笔者课题组实验室前期分离并鉴定的1株软腐病病原菌（菌株编号141108）。

1.1.2 试剂 NA培养基，其他药品均为国药分析纯。

1.1.3 仪器 微量移液器，法国吉尔森Pipetman系列;涡旋振荡器，德国IKAMS3 digital;智能生化培养箱，上海齐欣 KLH-250FD;恒温摇床，上海南荣NRY2102C;超净工作台，苏州净化SW-CJ-2D型;自动高压灭菌器，美国致微GR60DA等。

1.2 方法

1.2.1 根系土壤中细菌的分离 参考方中达的方法[7]，在NA培养基平板上分离纯化，根据平板上长出菌落的形态、颜色、透明度等性状挑取不同单菌落，划线纯化后接斜面4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 拮抗菌的离体球茎筛选 参考陈娇梅等的方法[8]略有改动。将根系土壤中分离的细菌和软腐病病原菌分别接种于NA液体培养基中，置于37 ℃、220 r/min摇床培养8 h备用。选取健康槟榔芋球茎，洗净并风干后，切取大小为长 5.0 cm、宽3.0 cm、厚0.5～0.7 cm的组织块，75%乙醇消毒1 min后使用0.1%氯化汞溶液消毒10 min，蒸馏水荡洗3次，将处理好的组织块置于放有滤纸的无菌培养皿中备用。将待测拮抗菌液和软腐病病原菌液按体积比1 ∶ 1混合。用无菌刀和镊子在处理好的组织块中央划1个长3.0 cm、宽1.0 cm、深0.2～0.3 cm的十字，接种5 μL混合菌液于槟榔芋组织块十字中央，以无菌水接种作为阴性对照，以软腐病病原菌和无菌水体积比1 ∶ 1混合接种作为阳性对照，置于 37 ℃ 恒温培养箱保湿培养，观察接种部位症状并拍照记录。以上每个处理设置5个重复。

1.2.3 拮抗机制的初步分析 平板拮抗试验参考龙超安的方法[9]略有改动。将100 μL的病原菌菌液（约1.0×109 CFU/mL）涂布于NA琼脂平板上，将直径为5 mm浸有拮抗细菌菌液（约1.0×109 CFU/mL）的滤纸片等距离放置在平板上，每个平板放置5个滤纸片，37 ℃恒温培养，观察抑菌圈，每个处理重复5次。菌悬液和无菌滤液拮抗试验分别参考谷会等的方法[10-11]。37 ℃恒温培养，观察抑菌圈，每个处理重复5次。

2 结果与分析

2.1 根系土壤中细菌的分离

采用平板稀释法从健康槟榔芋根际土壤共分离出53株细菌。编号：N01～N53。

2.2 拮抗菌的离体球茎筛选

接有待测候选拮抗细菌与致病菌混合菌液的槟榔芋组织块，4～5 d后芋块出现不同程度的变色，7 d后芋块出现不同程度的软腐;其中接种待测菌株N05、N07、N26、N41、N48、N50与致病菌混合菌液的槟榔芋组织块未发病，接种N06、N11、N32和致病菌混合菌液的槟榔芋组织块仅十字一侧出现轻微的软腐，无特殊气味出现。其他待测菌株以及接种软腐病病原菌的阳性对照组，5 d后芋块出现轻微变色，7 d后芋块腐烂，并散出腐烂臭味。注射无菌水的阴性对照组未发病（图1）。离体球茎防效测定结果表明，细菌N05、N07、N26、N41、N48、N50对软腐病病原菌具有明显的拮抗作用，细菌N06、N11、N32对软腐病病原菌致病力具有一定减轻作用。

2.3 拮抗机制的初步分析

2.3.1 平板拮抗试验 对9株有拮抗效果的细菌进行平板拮抗试验，只有菌株N26滤纸周围产生抑菌圈，抑菌圈大小为0.5～1.5 mm（图2），其他均无抑菌圈，说明在平板上对病原菌没有抑菌效应的细菌不一定没有生防效果。

2.3.2 菌悬液和无菌滤液拮抗试验 为确定拮抗菌的拮抗作用是菌体自身还是其产生的次生抑菌物质引起的，分别将N26菌株的菌悬液和无菌滤液对软腐病病原菌做平板拮抗试验。发现菌株N26的菌悬液对软腐病病原菌产生抑菌圈（图3-A）;菌株N26的无菌滤液对软腐病病原菌不产生抑菌圈（图3-B），说明N26对软腐病病原菌的拮抗作用不是因为其产生的次生抑菌物质引起的，而是由菌体自身引起。

3 结论

本试验从福建省福鼎市槟榔芋根际土壤分离出53株细菌，经离体球茎拮抗筛选，获得9株对槟榔芋软腐病具有拮抗效果的细菌，其中拮抗效果较好的细菌6株（N05、N07、N26、N41、N48、N50），能够减轻植物发病程度的细菌3株（N06、N11、N32）。平板拮抗试验结果表明，此次筛选到的拮抗细菌对病原菌的拮抗作用不是由于产生次生抑菌物质引起的，而是其他方式，如竞争作用、抗生作用、重寄生作用、溶菌作用等引起的拮抗效应，其拮抗机制及槟榔芋活体生防效果有待进一步研究阐明。本次试验筛选到的拮抗菌对软腐病病原菌的拮抗方式不会引起病原菌的耐药性突变，因此更为安全可行。

参考文献：

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