透骨消痛胶囊抑制大鼠骨关节炎软骨退变的实验研究

许丽梅 邵翔 曾建伟 贾良良 何晓娟 李慧 叶蕻芝 李西海

【摘 要】目的：探讨透骨消痛胶囊抑制骨关节炎软骨退变的机制。方法：将30只2月龄SPF级SD雄性大鼠按照随机数字表法分为空白对照组（10只）和模型组（20只）。模型组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型，按照随机数字表法分为模型对照组和透骨消痛胶囊组，每组10只。透骨消痛胶囊组用透骨消痛胶囊溶液（10 mL·kg-1·d-1）灌胃，空白对照组、模型对照组连续等剂量生理盐水灌胃，持续12周。观察大鼠股骨髁软骨的整体形态学变化情况，另使用HE染色和甲苯胺蓝染色观察大鼠软骨形态结构及软骨蛋白多糖的表达，并用ELISA法检测滑膜组织中炎症相关因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β），以及基质金属蛋白酶-13（MMP-13）水平。结果：HE染色結果表明，空白对照组关节软骨表面光滑平整，软骨细胞排列规则，层次清晰;模型对照组软骨表面粗糙，软骨细胞排列紊乱，软骨细胞异常分化;透骨消痛胶囊组关节软骨表面比模型对照组完整，层次较为清晰，软骨细胞形态较好。甲苯胺蓝染色显示，空白对照组软骨染色呈紫红色，染色较深且均匀;模型对照组软骨染色明显变浅;透骨消痛胶囊组软骨染色较模型对照组深，染色相对均匀。ELISA法检测结果显示，模型对照组滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平均高于空白对照组（P < 0.05），透骨消痛胶囊组低于模型对照组（P < 0.05），透骨消痛胶囊组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：透骨消痛胶囊能有效抑制炎症反应所引起的关节软骨退行性病变，延缓骨关节炎病理进程。

【关键词】 骨关节炎;透骨消痛胶囊;软骨退变;大鼠

inhibiting cartilage degeneration in osteoarthritis.Methods：Thirty two-month-old SPF SD male rats were randomly divided into a blank control group（10 rats）and a model group（20 rats）.The model group was divided into a model control group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group randomly after the models were established according to modified Hulth method，with 10 rats in each group.For 12 weeks，the rats in the Tougu Xiaotong Jiaonang group were given Tougu Xiaotong Jiaonang solution（10 mL·kg-1·d-1）by gavage，while the blank control group and the model control group were given orally the same dose of saline by gavage.The morphological changes of their femoral condylar cartilage were observed.The morphological structure of rat cartilage and the expression of cartilage proteoglycan were observed by HE staining and toluidine blue staining.Inflammation-related factors such as TNF-α，IL-1β and MMP-13 in synovial tissue were detected by ELISA.Results：HE staining showed that the surface of articular cartilage in the blank control group was smooth，the arrangement of chondrocyte was regular and the layers were clear.The surface of cartilage in the model control group was rough，the arrangement of chondrocyte was disordered，and the chondrocyte was abnormally differentiated.The surface of articular cartilage in the Tougu Xiaotong Jiaonang group was complete，the layers were clear and the shape of chondrocyte was good，all better than those in the control group.Toluidine blue staining showed that the cartilage staining in the blank control group was purple red，deep and even.The cartilage staining in the model control group was significantly lighter.The cartilage staining in the Tougu Xiaotong Jiaonang group was deeper and more uniform than that in the model control group.ELISA results showed that the level of TNF-α，IL-1β and MMP-13 in synovial tissue of the model control group were higher than those of the blank control group（P < 0.05），and the level of them in the Tougu Xiaotong Jiaonang group were lower than those of the model control group（P < 0.05）.There was no significant difference between the Tougu Xiaotong Jiaonang group and the blank control group（P > 0.05）.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can effectively inhibit the degenerative lesions of articular cartilage caused by inflammatory reaction and delay the pathological process of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）;cartilage degeneration;rats

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是由于膝关节局部生物学和力学的改变，引起软骨细胞、软骨细胞外基质以及软骨下骨三者合成-降解偶联机制失衡的一种慢性、进行性骨关节疾病[1]。随着人口老龄化不断增加，OA发病率随之增长[2]。目前，OA尚无特效疗法，主要以缓解症状、提高生活质量为主[3]。透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎、肿节风4味中药组成，具有补肝肾、强筋骨、止痹痛之功，是临床治疗OA的常用方。课题组前期研究发现，透骨消痛胶囊能有效改善OA的临床症状，降低炎症因子水平，减少含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶4（ADAMTS4）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）分泌[4-5]。因此，本研究拟进一步分析透骨消痛胶囊干预OA动物模型的作用及相关炎症因子水平变化。以改良Hulth法复制OA动物模型作为研究对象，采用病证结合的方法，从以方测证的角度探讨透骨消痛胶囊抑制OA软骨退变的作用机制，以期为临床运用透骨消痛胶囊提供相关理论支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠30只，2月龄，体质量（200±20）g，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司，由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号SCXK（沪）2012-0002。动物实验方案通过医学动物实验伦理委员会审批。

1.2 实验药物 透骨消痛胶囊为福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂，闽制字Z20100006，药物组成：巴戟天12 g、白芍12 g、川芎6 g、肿节风6 g。按照上述药物剂量称取药材，加入14倍药量体积的蒸馏水，经高温加热2 h回流提取药液，共重复提取2次，合并2次药液后过滤，滤液采用旋转蒸发浓缩后4 ℃保存备用。

1.3 实验试剂与仪器 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、MMP-13 ELISA试剂盒（美国R&D公司）;质量分数为10%的水合氯醛（中国天津福晨化学试剂厂）;质量分数为4%的多聚甲醛（郑州德众化学试剂厂）;甲苯胺蓝（国药集团化学试剂有限公司）;HE染色试剂盒（中国北京索莱宝公司）。光学显微镜（德国Leica公司）;ELX-800酶标仪（美国Bio-tek公司）。

2 方 法

2.1 实验动物模型建立与分组 将30只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组（10只）和模型组

（20只）。模型组采用改良Hulth法（切断内侧副韧带与前交叉韧带、摘除内侧半月板），建立双侧大鼠骨关节炎模型[6]，按照随机数字表法分为模型对照组和透骨消痛胶囊组，每组10只。

2.2 药物干预 大鼠给药剂量按人和动物药物等效剂量换算[7]，计算后根据实验需要，将透骨消痛胶囊溶液浓缩至含生药量0.308 g·mL-1。

透骨消痛胶囊组给予透骨消痛胶囊溶液

10 mL·kg-1·d-1灌胃，空白对照组、模型对照组以生理盐水10 mL·kg-1·d-1灌胃，持续12周。

2.3 实验动物取材与形态观察 质量分数为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取双侧膝关节滑膜组织、双侧膝关节股骨髁。股骨髁采用质量分数为4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，经HE染色和甲苯胺蓝染色后，显微镜下观察关节软骨组织形态学变化。

2.4 ELISA法检测滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平 精密称取20 mg滑膜组织，加入磷酸盐缓冲剂，冰上超声粉碎，4 ℃，离心机以12 000 r·min-1离心20 min，吸取上清液。根据ELISA试剂盒说明书进行操作测得OD值，建立标准曲线代入OD值计算出各样品TNF-α、IL-1β、MMP-13数值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。ELISA法检测滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平的组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 关节软骨整体形态观察 空白对照组各股骨髁软骨表面光滑完整，富有光泽、弹性，关节边缘平整，无缺损、裂纹和骨赘，见图1（1）。模型对照组软骨表面异常粗糙，无光泽，可见局部表面软骨缺损，软骨下骨裸露，软骨边缘失去完整性并伴骨赘生成，见图1（2）。透骨消痛膠囊组软骨面基本完整，略粗糙，关节边缘有轻微骨赘，未见软骨下骨裸露，见图1（3）。

3.2 HE染色观察膝关节软骨组织形态 空白对照组关节软骨表面光滑平整，各层结构清晰，界限清楚，软骨细胞排列规则、分布均匀，细胞核染色呈蓝色，软骨基质着色均匀，呈浅粉红色，见图2（1）。

模型对照组关节软骨表面粗糙不平，各结构层次紊乱，软骨细胞排列欠佳，可见肥大分化软骨细胞，软骨下骨有髓腔形成，见图2（2）。透骨消痛胶囊组关节软骨表面较为平滑完整，且有着清晰的层次，软骨细胞排列和分层较为规律完整，

见图2（3）。

3.3 甲苯胺蓝染色观察关节软骨蛋白多糖变化 空白对照组软骨染色为紫红色，软骨表面完整，软骨上部分染色深而均匀，软骨细胞排列整齐，见图3（1）;模型对照组软骨染色呈浅蓝色，软骨细胞排列失去规则，并可见肥大软骨细胞，见图3（2）;透骨消痛胶囊组软骨染色呈蓝紫色，染色相对均匀，软骨细胞未见明显肥大现象，见图3（3）。

3.4 ELISA法检测滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平比较 ELISA检测结果显示，模型对照组滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平高于空白对照组（P < 0.05），透骨消痛胶囊组滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平低于模型对照组（P < 0.05）;透骨消痛胶囊组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

4 讨 论

OA属中医学“痹证”“痿证”范畴，因风、寒、湿邪等侵犯机体，邪阻经络，气血运行不畅而发病，早期以关节疼痛、麻木、屈伸不利等为主要表现。基于OA本痿标痹的核心病机[8]，临床治疗多采用补肾柔肝，活血祛风，标本兼治之法[9-10]。透骨消痛胶囊以巴戟天为君药，温阳补肾以治本;白芍为臣药，养血柔肝;川芎为佐藥，活血行血;肿节风为使药，祛风除湿。四药合用，共奏补肝肾、强筋骨、止痹痛之功，标本兼治。

从关节的整体形态观察、HE染色及甲苯胺蓝染色可以看出，模型对照组大鼠膝关节呈现典型的OA病变特征，主要有关节表面粗糙不平、软骨层变薄，四层结构不清晰，同时伴有软骨细胞肥大，排列紊乱，甚者有骨赘形成。说明改良Hulth法能够成功复制大鼠OA动物模型。透骨消痛胶囊干预OA模型大鼠后，大鼠关节软骨病变程度明显轻于模型对照组，镜下观察可见关节软骨细胞无明显肥大分化，着色尚均匀，软骨表面相对完整且无明显骨赘形成。说明透骨消痛胶囊可以促进蛋白多糖和软骨基质的合成分泌，有效减缓关节软骨的退行性改变。

目前认为，OA的主要病理特征为软骨细胞凋亡及软骨基质进行性降解导致关节软骨的变性破坏、滑膜慢性炎症、骨赘形成等[11]。随着对OA发病机制研究的逐渐延伸，滑膜在OA病理进程中的作用不断地被挖掘出来。滑膜作为关节的重要组成部分，能够分泌关节液，营养关节软骨、润滑关节面以减少摩擦，并能排泄废物，对关节软骨的营养代谢及关节内环境的稳定十分重要[12]。当滑膜受到刺激时会产生一系列的炎症反应，导致大量细胞因子、趋化因子、活性氧和MMPs等分泌到滑液中[13]。其中MMPs是导致关节软骨破坏的重要酶类，MMP-13作为其中一员，其过度表达会导致胶原及蛋白多糖过度降解[14]。而TNF-α、IL-1β是导致关节炎症损伤的重要炎性因子，在破坏软骨细胞及软骨基质的同时[15]，还会促进MMPs的表达，从而加重软骨基质的降解。同时，两者还可协同刺激滑膜细胞，加重关节滑膜炎症。由此可见，滑膜炎会使关节腔内相关炎症因子表达增加，从而进一步加重软骨退变。本研究结果显示，模型对照组滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平显著升高，表明OA与滑膜炎症相关。而透骨消痛胶囊干预OA大鼠后，明显抑制了滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13的表达，说明抑制滑膜炎症能够成为有效治疗OA的靶点之一。

综合以上实验结果，透骨消痛胶囊可以下调TNF-α、IL-1β、MMP-13的水平，抑制OA炎症反应，改善炎症对关节软骨的破环，延缓软骨基质降解，达到抑制关节软骨退变的功效。但本实验尚缺乏相关作用机制及作用靶点的研究，在今后的研究中会增加多组设计，继续开展多层次、多角度、多学科的研究，以进一步加深对透骨消痛胶囊作用机制的认识。

5 参考文献

[1] CORR EM，CUNNINGHAM CC，HELBERT L，et al.Osteoarthritis-associated basic calcium phosphate crystals

activate membrane proximal kinases in human innate immune cells[J].Arthritis Res Ther，2017，19（1）：23.

[2] 中华医学会骨科学分会关节外科学组.骨关节炎诊疗指南（2018版）[J].中华骨科杂志，2018，38（12）：705-715.

[3] SUN MM，BEIER F，PEST MA.Recent developments in emerging therapeutic targets of osteoarthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2017，29（1）：96-102.

[4] 陈鸿，洪昆达.透骨消痛胶囊治疗疼痛性膝骨性关节炎30例[J].福建中医药，2015，46（2）：21-22.

[5] 邵翔，陈后煌，陈达，等.透骨消痛胶囊抑制脂多糖诱导软骨细胞炎症反应的机制研究[J].国际骨科学杂志，2016，37（6）：406-410.

[6] 刘献祥，李西海，周江涛.改良Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1104-1108.

[7] 黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-1072.

[8] 李照辉，梁珪清，刘伯龄，等.骨关节炎“本痿标痹”内涵探讨[J].风湿病与关节炎，2015，4（7）：37-39.

[9] 李西海，陈文列，刘献祥.补肾柔肝法防治骨性关节炎作用机制探讨[J].福建中医药大学学报，2011，21（2）：66-69.

[10] 李西海，陈后煌，叶蕻芝，等.补肾柔肝法治疗骨关节炎筋骨失养的作用探讨[J].风湿病与关节炎，2016，5（6）：40-42，46.

[11] BARR AJ，CAMPBELL TM，HOPKINSON D，et al.A systematic review of the relationship between subchondral bone features，pain and structural pathology in peripheral joint osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2015，17（1）：228.

[12] ASIF AMIN M，FOX DA，RUTH JH.Synovial cellular and molecular markers in rheumatoid arthritis[J].Semin Immunopathol，2017，39（4）：385-393..

[13] MALEMUD CJ.Matrix Metalloproteinases and Synovial Joint Pathology[J].Prog Mol Biol Transl Sci，2017，148（1）：305-325.

[14] AMAR S，SMITH L，FIELDS GB.Matrix metalloproteinase collagenolysis in health and disease[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2017，1864（11 Pt A）：1940-1951.

[15] CHARLIER E，RELIC B，DEROYER C，et al.Insights on Molecular Mechanisms of Chondrocytes Death in Osteoarthritis[J].Int J Mol Sci，2016，17（12）：E2146.

收稿日期：2019-04-20;修回日期：2019-05-26