电针内关穴对缺氧诱导心肌损伤SD大鼠HIF-1α及VEGF的影响

修春英 ，陈 白 ，赵莉莉 ，汪 欣

（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州350003；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州350003）

心血管疾病的发生是多种不良因素长期相互作用的结果，已成为危害人类健康、导致疾病和死亡的一个主要原因，而缺氧诱导的心肌损伤是心血管疾病的主要致病因素之一［1］。前期研究表明，针刺手厥阴心包经穴位对急性缺氧下心功能损伤具有调节作用［2］，而 缺氧诱导因 子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是机体缺氧反应中的关键作用因子。由此推测，手厥阴心包经的针刺效应可能与调控HIF-1α、VEGF相关。在此基础上，本研究通过建立大鼠慢性缺氧模型，观察针刺心包经内关穴对HIF-1α、VEGF的影响，从而探讨其疗效机制，现将结果报告如下。

1 实验材料

1.1 动物与分组 SD大鼠60只，体质量160～200 g，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（闽）2012-0001。随机分为正常对照组、模型组、内关组，每组20只。

1.2 主要仪器与试剂 低氧混合气体（12%O2，88%N2，福州中铭工业气体有限公司）；Trizol Reagent（美国 Invitrogen 公司）；SYBY Premix Ex TaqTM、Prime-Script逆转录试剂盒（日本TakaRa公司）；大鼠VEGF定量酶联检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ALLEGRA 64R型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）；CODA型全自动酶免分析仪（美国Bio-Rad公司）；WQ-10D1型多用电子穴位测定治疗仪（北京市海淀东华电子仪器厂）；1寸华佗牌一次性使用无菌针灸针 （苏州医疗用品厂有限公司）。

2 实验方法

2.1 模型建立 参照文献［3］的造模方法，将模型组和内关组大鼠置于低氧舱内，持续通入低氧混合气体（12%O2，88%N2）12 h，随后通入空气 12 h，连续12 d；对照组在相同的舱体内通入空气。低氧舱内压强、温度和湿度保持一致，CO2浓度维持在0～0.8%范围内。

2.2 电针参数 建立模型后内关组进行电针内关穴干预，每日1次，每次30 min，连续5 d。疏密波，刺激频率10／20 Hz，强度以肢体出现轻微颤动为度［4-5］。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 实时定量 PCR法检测 HIF-1α、VEGF的mRNA表达 ① 采用Trizol法抽提大鼠心肌组织的总RNA，通过OD260／OD280值进行 RNA纯度及含量的测定。取2 μg总RNA进行逆转录反应。引物序列如下：HIF-1α：上游引物5'-CAAAACACACAG CGAAGC-3'，下游引物 5'-TCAACCCAGACATATCC ACC-3'，扩增产物长度 473 bp；VEGF：上游引物5'-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3'，下游引物 5'-ACTC CAGACCTTCGTCGTTG-3'，扩增产物长度 240 bp；βactin：上游引物 5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'，下游引物5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'，扩增产物长度156 bp。② 去除基因组DNA：用DNase I消化RNA样品，去除其中可能含有的基因组DNA。RNA纯化及质量检测：用RNA纯化试剂盒纯化RNA，紫外吸收测定法测RNA浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。③cDNA合成：逆转录试剂盒合成cDNA。④ 实时定量PCR：将配好的混合液加到PCR Array对应的每个孔中，然后置PCR Array于实时定量PCR仪进行PCR反应。反应条件：94℃预变性5 min后，94℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环后 72℃维持5 min。数据分析：采用ΔΔCt方法，先计算每个样本的 ΔCt，ΔΔCt＝ΔCt（组别）－ΔCt（正常对照组），最后通过2-ΔΔCt计算各组别与对照组对应基因的表达差异。

2.3.2 ELISA法检测VEGF蛋白的含量 将心肌组织按1∶6加入匀浆缓冲液研磨成组织匀浆，10 000 r／min离心10 min，取上清，匀浆液置-20℃冰箱贮存备用。检测方法按试剂说明书进行，用全自动酶免分析仪测定结果，检测波长为450 nm。

2.4 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析，在方差齐性的情况下，两两比较采用LSD检验，方差不齐情况下用Dunnett’s T3检验。

3 结 果

3.1 3组大鼠 HIF-1α、VEGF的 mRNA表达变化比较 见表1。

表1 3组大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表达变化比较（）

表1 3组大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表达变化比较（）

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组模型组内关组n 20 20 20 HIF-1α 1 1.81±0.541）3.41±0.321）2）VEGF 1 2.17±0.811）3.50±0.171）2）

3.2 3组大鼠VEGF蛋白水平变化比较 见表2。

表2 3组大鼠VEGF蛋白水平变化比较（）

表2 3组大鼠VEGF蛋白水平变化比较（）

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组模型组内关组n 20 20 20 VEGF／（μg／L）1.80±0.19 2.25±0.271）2.61±0.251）2）

4 讨 论

缺氧是临床常见的病理类型，不仅见于传统的高原环境缺氧，随着现代生活方式的改变，生活中有氧运动不足再加上环境污染，人类已不知不觉处在慢性缺氧的环境中。研究表明，缺氧诱导的氧化应激反应与高血压病、动脉粥样硬化、缺血性心脏病等多种心血管疾病密切相关，并导致心脏受累而引发缺血性心脏病、肺源性心脏病和贫血性心脏病［6-7］。HIF-1α是目前发现具唯一特异在低氧状态下发挥活性的转录因子，在缺氧诱导基因的表达调节过程中起关键作用［8］。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性及促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成的作用。HIF-1α能使VEGF的转录和表达增强，增加血管生成，使血液到达缺氧部位，从而降低因缺氧带给机体的损伤［9］。

基于缺氧在心血管疾病过程的重要性，慢性缺氧模型成为模拟心血管疾病的常用动物模型。本研究通过持续通入低氧混合气体的方法制备慢性缺氧的模型，结果显示在慢性缺氧的环境中，大鼠心肌组织的HIF-1α、VEGF的mRNA的表达增加，同时VEGF的蛋白含量增加，证实了慢性缺氧下心肌组织的应激反应。

《灵枢·经脉》曰：“心主手厥阴心包络之脉，起于胸中，出属心包络。”经脉所过，主治所及，研究证实，针刺手厥阴心包经穴位具有良好的心肌保护效应［10］。前期研究显示，循手厥阴心包经取穴，电针内关穴、天泉穴对缺氧状态下的心功能具有良好的调节作用［2，11］。 鉴于以上的相关研究和前期研究，本研究选取内关穴作为研究手厥阴心包经的代表穴位。内关穴作为手厥阴心包经的络穴、八脉交会穴，是临床手厥阴心包经治疗心血管疾病最常用、最具代表意义的穴位。本研究结果显示，针刺内关穴能增加HIF-1α、VEGF的mRNA表达，同时心肌组织的VEGF蛋白含量也明显升高，表明内关穴可以通过调节对HIF-1α、VEGF的mRNA的表达，从而增加血管生成，提高机体对缺氧的耐受性，对缺氧诱导的心肌损伤具有保护作用。

综上所述，针刺手厥阴心包经内关穴具有对抗缺氧诱导心肌损伤的作用，其作用机制可能与介导HIF-1α、VEGF的调控相关，从而为临床应用手厥阴心包经防治心肌缺氧所致疾病提供部分理论依据。