鹿瓜多肽对脐带间充质干细胞增殖、迁移和抗炎因子分泌的影响

李世梅，王黎明※，李 铭，汤 慧，李 峰，刘文聘，潘志荣

(1.空军第九八六医院中医科，西安 710054； 2.西安交通大学第二附属医院泌尿外科，西安 710004；3.陕西九州生物医药科技集团有限公司，西安 710065)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以炎症性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，可引起完全的关节损伤及多种关节外症状和全身症状。如果没有得到及时的诊断与治疗，可能会导致患者出现残疾和过早死亡[1]。有研究发现RA与HLA-B27基因的表达密切相关，但发病机制目前尚不明确[2]。随着各种新型生物制剂的出现及治疗原则和治疗策略的优化，RA的治疗取得了重大进展，患者的预后得到明显改善[3-4]。然而，各种治疗均有其局限性，如引起皮疹、发热、过敏反应等药物不良反应，且在某些患者中疗效有限。因此，亟需探索新型的治疗方法及其作用机制[5]。人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)因具有组织修复、抗炎和调节免疫多重作用，近年成为RA治疗领域有前景的治疗方法[6-8]。研究表明，UC-MSC可以安全、有效和持久地缓解RA的症状[9-10]。在治疗RA方面具有非常高的安全性和有效性，且患者的耐受性良好[11]。另外，鹿瓜多肽(lugua polypeptides，LG)前期干预UC-MSC能够显著增加UC-MSC治疗RA的有效性，但具体机制尚不清楚[12]。本研究通过体外细胞模型，旨在探索LG对UC-MSC增殖、迁移和抗炎因子分泌的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 人UC-MSC由陕西九州生物医药科技集团有限公司馈赠。LG购自哈尔滨誉衡药业(批号：161113)。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(批号：C0221A)和曲拉通X-100(批号：ST795)购自上海碧云天生物技术有限公司。抗荧光淬灭封片剂(批号：0100-01)购自美国Southern Biotech公司。KeyFluor488 Click-iT EdU成像检测试剂盒(批号：KGA331-50)购自南京凯基生物科技发展有限公司。玻片(85680-3101-12)及盖玻片(80340-0630)购自江苏世泰实验器材有限公司。DMEM/F12(批号：10565018)培养基和胎牛血清(批号：10099141)购自美国Invitrogen公司。0.25%胰酶(批号：15050065)、碱性成纤维细胞生长因子(批号：13256-029)和青霉素/链霉素双抗(批号：15140-122)购自美国Gibco公司。细胞培养皿(430167)和6孔板(CLS3516-50EA)购自美国Corning公司。Transwell小室(353097)购自美国FALCON公司。微量移液器和全自动酶标仪(Multiskan MK3)购自美国ThermoFisher公司。超净工作台(SW-CJ-1FD)购自苏州安泰空气技术有限公司。CO2恒温培养箱(MCO-15AC)购自日本SANYO公司。低速离心机购(5702R)自美国Eppendorf公司。荧光显微镜(IX71)及倒置显微镜(IX51)均购自日本OLYMPUS公司。微型高速离心机(C2500-R-230V)购自美国Labnet公司。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)(批号：H181)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)(批号：H099)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，肿瘤坏死因子-α诱导蛋白6(tumor necrosis factor-α inducible protein 6，TSG6)(批号：LS-F12868-1)ELISA试剂盒购自美国LifeSpan公司。

1.2细胞培养 人UC-MSC培养于含10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10% 胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中。细胞培养箱的孵育条件设置为37.0 ℃、5% CO2和95%湿度。

1.2.1细胞复苏 将UC-MSC从液氮取出后，于37 ℃水浴锅中迅速解冻。转移溶解后的细胞至含有5 mL无血清培养基的离心管中，室温300×g离心5 min，弃上清液。使用完全培养基(含10% 胎牛血清)重新悬浮细胞，然后将重悬后的细胞接种至培养皿，轻柔吹打以混合混匀，置于细胞培养箱中培养。

1.2.2细胞传代 当细胞密度约为80%时，对细胞进行传代。PBS洗3次后，使用0.25%胰酶消化细胞，完全培养基终止消化后收集细胞于10 mL离心管中，室温300×g离心5 min，弃上清液。加入完全培养基，轻柔吹打细胞，制成单细胞悬液，按1∶3 的比例传代。

1.3实验方法 待细胞呈对数生长且状态良好时，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中，共种4个孔，培养过夜。弃尽旧培养基，分别加入不含(对照组)或含4、8和12 μg/mL LG的完全培养基，设为对照组、4 μg/mL LG组、8 μg/mL LG组和12 μg/mL LG组。

1.3.1EdU细胞增殖实验 细胞分组后，继续培养48 h。在6孔板中取出爬片，PBS洗3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定15 min后PBS洗3次，每次3 min。弃去固定液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入1 mL含0.5%曲拉通X-100的PBS，室温孵育20 min。弃尽每孔中的液体，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入0.05 mL Click-iT反应混合物，室温避光孵育30 min。去除反应液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后PBS洗1次，弃尽洗涤液。每张爬片滴加100 μL 1×Hoechst 33342反应液(5 μg/mL)，避光，室温孵育15 min后，PBS洗3次，每次3 min。吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后置于荧光显微镜下。在低倍视野下找到细胞后，换至400×，在蓝色激发光下拍摄EdU绿色荧光，在紫外激发光下拍照Hoechst绿色荧光，通过photoshop CS5软件将这两张图片融合并计数。每张爬片随机挑取5个视野拍摄图片。

1.3.2Transwell细胞迁移实验 细胞分组后，继续培养24 h。消化离心后，使用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至3×105/mL，每个Transwell小室内加入200 μL制备好的细胞悬液，每种处理种3个小室。Transwell小室的下室加入800 μL含10% 胎牛血清的完全培养基。置入细胞培养箱培养24 h后，取出Transwell，用PBS小心地清洗小室1次，70%冰乙醇溶液固定细胞1 h。0.5%结晶紫染液室温下染色20 min后弃尽染液，PBS洗3次，用干净的棉签将上室一侧未迁移的细胞擦干净，将小室倒置于载玻片上，于正置显微镜下观察。在低倍视野下找到细胞后，换至100×并拍照。每个小室随机挑取5个视野拍摄图片。

1.3.3ELISA实验 细胞分组后，继续培养48 h。取细胞培养上清液，(500～1 000)×g离心20 min后开始检测。设3组孔：空白孔、标准品孔和样品孔。空白孔不加样，只加入显色剂A、显色剂B和终止液，用作调零；每个标准品孔中加入50 μL稀释好的标准品，其中0浓度孔加入50 μL标准品/样品稀释液，之后加入50 μL生物素抗原工作液；每个样品孔中加入50 μL样品，之后加入50 μL生物素抗原工作液。轻轻摇晃混匀各孔中的溶液，封上封板膜，置于37 ℃恒温箱中孵育60 min。孵育完后，谨慎揭开封板膜，弃尽每孔中的液体，向每孔中加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复此操作5次，然后弃尽每孔中的液体。向每个标准品孔和样品孔加入50 μL亲和素-辣根过氧化物酶，操作方法同上。先向每孔加入50 μL显色剂A，然后加入50 μL显色剂B，轻柔震荡混合均匀，在37 ℃下避光反应 10 min。之后向每孔中加入50 μL终止液以终止反应。将ELISA孔板置入多功能酶标仪中，使用空白孔调零，然后在450 nm波长下测量各孔的吸光度值。使用标准品的浓度和相应吸光度值绘制标准曲线，然后采用此标准曲线根据各指标(HGF、PGE2和TSG6)的吸光度值计算得出相应的浓度。

2 结 果

2.1各组EdU细胞增殖实验结果 在EdU细胞增殖实验中，LG处理UC-MSC后，对照组、4 μg/mL LG组、8 μg/mL LG组和12 μg/mL LG组中EdU阳性细胞数分别为(12.35±3.67)个细胞/400×视野、(24.23±7.12)个细胞/400×视野、(39.61±7.98)个细胞/400×视野和(64.44±15.32)个细胞/400×视野，各组EdU阳性细胞数比较差异有统计学意义(F=43.590,P<0.001)；与对照组比较，各处理组的EdU阳性细胞数增加(P<0.05)。见图1。

2.2各组Transwell细胞迁移实验结果 在Transwell 细胞迁移实验中，LG处理UC-MSC后，对照组、4 μg/mL LG组、8 μg/mL LG组和12 μg/mL LG组中迁移细胞数分别为(20.00±2.00)个细胞/100×视野、(32.33±2.52)个细胞/100×视野、(50.33±2.52)个细胞/100×视野和(71±3.61)个细胞/100×视野，各组迁移细胞数比较差异有统计学意义(F=199.500，P<0.001)；与对照组相比，各处理组的迁移细胞数增加(P<0.05)。见图2。

1a：对照组；1b：4 μg/mL LG组；1c：8 μg/mL LG组；1d：12 μg/mL LG组

图1 各组EdU细胞增殖实验结果(荧光染色，400×)

2a：对照组；2b：4 μg/mL LG组；2c：8 μg/mL LG组；2d：12 μg/mL LG组

图2各组Transwell细胞迁移实验结果(0.5%结晶紫染液染色，100×)

2.3各组ELISA实验结果 在ELISA实验中，LG处理UC-MSC后，各组HGF、HGE2、TSG6比较差异有统计学意义(P<0.01)，与对照组相比，4 μg/mL LG组、8 μg/mL LG组和12 μg/mL LG组HGF、PGE2和TSG6的分泌量显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组ELISA实验结果

LG：鹿瓜多肽；UC-MSC：脐带间充质干细胞；HGF：肝细胞生长因子；PGE2：前列腺素E2；TSG6：肿瘤坏死因子-α诱导蛋白6；a与对照组比较，P<0.05

3 讨 论

近年来，虽然RA的临床治疗取得了突破性进展，但仍有2个重大问题有待解决：①约30%的患者对所有治疗无应答；②即使RA的临床炎症得到缓解，但仍会出现影像学上的关节损伤[13-16]。这提示，RA的关节损伤不仅与炎症有关，且单纯的抗感染治疗可能不足以阻止RA的进展。在RA治疗领域，特别是对当前治疗反应不佳的RA患者，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)显示出广阔的治疗前景[17]。其主要从两个方面对RA发挥治疗作用：①细胞分化，MSC可以分化成受损的细胞(骨细胞和软骨细胞)，从而直接修复受损细胞；②免疫调节，MSC可以通过调节性T细胞介导的免疫应答、抑制各种固有免疫细胞的产生及其功能等方式起到抗炎、调节免疫和抗组织损伤等作用[18-20]。

除细胞分化外，MSC的增殖和迁移能力也与其对受损组织的修复密切相关。细胞的增殖决定了最终可分化为靶细胞的MSC数量，而细胞的迁移决定了最终能够到达受损部位的MSC数量[21]。因此，若能促进MSC的增殖和迁移，则可潜在地增强MSC的治疗效果。本研究通过EdU细胞增殖实验和Transwell 迁移实验发现，LG可显著促进UC-MSC的增殖和迁移，且呈浓度梯度依赖效果。然而，目前LG促进UC-MSC增殖和迁移的具体分子机制尚不清楚。研究发现，多种信号通路可能参与对UC-MSC增殖和迁移的调节，包括c-Jun 氨基端激酶-p38通路[22]、黏着斑激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路[23]和胞外信号调节激酶通路[24]等，而LG对UC-MSC增殖和迁移的促进作用是否涉及这些信号通路或其他信号通路，有待进一步研究。

为研究LG对UC-MSC免疫调节作用的影响，本研究使用ELISA实验对经典抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌进行了研究。结果显示，LG可浓度依赖性地促进这3种抗炎因子的分泌，提示LG可通过增强UC-MSC的免疫调节功能，从而增强UC-MSC治疗RA的有效性。然而，这仅为体外研究的结果，有关LG对UC-MSC免疫调节作用的影响还需进一步的体内研究证实。另外，相关作用的潜在分子机制尚不清楚，需要更多的研究去阐明。

综上所述，LG可促进UC-MSC的增殖、迁移及抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌，这可能为其增强UC-MSC治疗RA有效性的潜在机制，从而为UC-MSC治疗RA提供更多的理论基础。