Linc00460通过下调miR-654-3p在食管癌中发挥促癌作用

杨振威，赵 倩，庄 坤，韩 坤，和水祥，刘亚萍

(1. 西安市中心医院消化内科，陕西西安 710004；2.西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西西安 710061)

依据SEER数据库，食管癌患者的5年生存率仅19.2%，2018年的新发病例数为17 290例，而预计死亡数为15 850例；且在白人中腺癌(66%)的发病率远高于鳞癌(32%)[1-2]。而我国食管鳞状细胞癌(ESCC)是食管癌的重要组织学类型，例如：林州市2003-2012年间鳞癌新发病例占总新发病例的85.3%[3]。因此，本研究纳入了食管鳞癌患者。我国食管癌的发病率不容乐观，贺宇彤等[4]通过分析全国肿瘤登记中心共255个肿瘤登记处的数据，发现我国平均食管癌发病率为20.35/10万，其中城市地区食管癌发病率为13.38/10万，农村地区为28.44/10万。食管鳞癌的诊治现状也不太乐观，很多患者在首诊时处于晚期，常常有局部浸润和转移，已经失去了手术机会[5]。现阶段对食管癌发生发展的机制尚不清楚，难以发现准确的肿瘤标志物用于食管癌的筛查[6]，亟待寻找新的食管鳞癌标志物。

长链非编码RNA(lncRNAs)是一系列长度大于200 nt的非编码RNA，主要特点是缺少蛋白质编码功能[7]。目前，国内外文献已经报道了许多lncRNA参与肿瘤的发生，在肿瘤组织中异常表达，影响肿瘤细胞的生物学功能，提示其有成为肿瘤标志物的潜力[7-9]。lncRNA已被证明可以调节癌细胞行为，包括癌症进展、细胞转移和耐药性[9]。以往的研究发现，linc00460在食管鳞癌细胞中异常高表达，影响癌症的发展和预后[10]。有基因芯片检测结果提示linc00460在食管癌组织和正常组织之间有较大的变化；进一步实验提示其可能作为癌基因发挥功能，但其下游机制尚不清楚。通过starbase的预测，我们发现miR-654-3p很可能作为linc00460的下游发挥抑癌功能。既往研究提示miR-654-3p在甲状腺癌中低表达，发挥着抑制甲状腺癌发生发展的作用[11]；提示其可能具有抑癌基因的作用，但有关其在食管癌中的作用尚未见相关报道。本研究首次探索linc00460/miR-654-3p的调控关系，并且证实了其在食管癌发生发展中的重要作用，提示linc00460/miR-654-3p有作为食管癌肿瘤标志物的潜力，但机制仍需进一步研究。

1 资料与方法

1.1 食管癌患者临床资料与分析标本取自西安交通大学第一附属医院2010年至2013年病理证实的食管癌手术切除病例，收集121例食管癌术后组织标本(食管癌组)及相应癌旁组织(对照组)，并收集其临床病理资料，研究已通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准。纳入标准为：经病理检查首次确诊为原发食管鳞癌；未合并其他肿瘤；患者一般情况良好，无严重的呼吸系统、循环系统、神经系统等并发症；术前无相关化疗及放疗；自愿参与本研究，并签订知情同意书。排除标准为：未签署知情同意书；伴有其他严重的系统性疾病；既往已接受治疗的患者；无手术指征的患者；为食管胃结合部肿瘤；患者主动要求退出。将121例食管癌患者分为linc00460高表达组及linc00460低表达组，分析两组患者间临床指标的差异，并进行生存分析。

1.2 细胞培养和转染用食管癌KY-SE和Eca-109细胞系和正常食管HEEC细胞系(均购自ATCC公司)于37 ℃、50 mL/L CO2、950 mL/L湿度条件下，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养。细胞转染所需的linc00460敲除慢病毒和miR-654-3p的过表达及敲除慢病毒均购买自上海吉凯公司。载体信息如下：上调载体hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin；下调载体hU6-MCS-CMV-EGFP。使用上述慢病毒，在Eca-109细胞系中分别构建稳定过表达和低表达miR-654-3p细胞株及稳定低表达linc00460细胞株。

1.3 CCK8实验收集处于对数期的Eca-109细胞，随后调整细胞悬液种植于96孔板中(1×105/孔)，每孔添加细胞悬液100 μL，标记为实验孔；对照组则使用无菌PBS，标记为对照孔。之后每孔中加入20 μL CCK-8溶液(5 mg/mL，上海碧云天)。分别于接种细胞后24、48、72 h时，使用酶联免疫检测仪在A490 nm处测量实验孔与对照孔的吸光值。

1.4 RNA的提取和qRT-PCR使用Trizol试剂(Invitrogen公司)分别提取患者食管癌组织及培养的转染细胞的总RNA；逆转录用15 μL RNA模板与2 μL RT引物(500 nmol/L)，在70 ℃ 10 min和4 ℃ 4 min后，加入5 μL RT缓冲液、足量的dNTPs、2 μL Mixture、0.5 μL逆转录酶以及7.5 μL DEPC水。应用SYBR Premix ExTaqTM实时定量PCR试剂盒，根据说明书进行操作。反应条件：95 ℃变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；60 ℃ 20 s，共30个循环。使用2-△△CT方法计算miR-654-3p和linc00460的表达水平。引物均购自TaKaRa(日本)。

1.5 双荧光素酶报告实验构建含有miR-654-3p预测位点的linc00460片段的荧光素酶报告基因(PGL3)。分别使用miR-654-3p+pGL3-linc00460-WT、miR-654-3p+pGL3-linc00460-Mut、miR-654-3p-NC+pGL3-linc00460-WT、miR-654-3p-NC+pGL3-linc00460-Mut转染Eca-109细胞系。使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega)检测细胞的荧光值。使用萤火虫/海肾荧光值表示各组报告基因的激活水平。

1.6 统计学分析所有计量资料以平均值±标准差表示。qRT-PCR分析结果使用配对样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。用卡方检验分析linc00460高表达组及linc00460低表达组食管癌患者临床指标的差异，通过log-rank检验及COX回归模型进行生存分析。通过R软件绘制nomogram；使用C-index进行nomogram的内部检验；所使用的R包为：“rms”、“Hmisc”、“lattice”、“survival”、“Formula”、“ggplot2”、“foreign”；R版本为3.4.1。

2 结 果

2.1 Linc00460及miR-654-3p在食管癌组织中的表达情况qRT-PCR检测结果显示，Linc00460在121例食管鳞癌中相对癌旁组织(对照组)为高表达(t=4.23，P<0.05)；miR-654-3p在121例食管癌组织中相对癌旁组织(对照组)为低表达(t=7.82，P<0.05，图1)。卡方检验提示miR-654-3p在linc00460高表达组和低表达组中表达差异有统计学意义(P<0.05，表1)；linc00460表达情况与T、N分期相关(P<0.05，表1)。

图1 食管癌组织和癌旁组织中linc00460(A)及miR-654-3p(B)的表达

Fig.1 Expressions of linc00460 (A) and miR-654-3p (B) in esophageal cancer and para-cancer tissues

**P<0.01。

2.2 Linc00460及miR-654-3p的生存分析Log-rank分析提示，linc00460高表达与食管鳞癌较差的预后有关，而miR-654-3p高表达与食管鳞癌较好的预后有关(表2)。

2.3 Linc00460及miR-654-3p的nomogram依据与预后相关的因素(表2)建立COX模型，提示N分期、linc00460与食管鳞癌不良预后有关，而miR-654-3p与食管鳞癌良好预后有关(表3)。对N分期、linc00460级miR-654-3p绘制nomogram(图2)，提示miR-654-3p对食管鳞癌的预后的影响最大。一致性检验C-index为0.734(0.633～0.852)，提示该nomogram可信度良好。

表1 Linc00460表达与食管癌患者临床特征的相关性

Tab.1 The association of linc00460 expression level with clinical characteristics of esophageal cancer patients

临床特征nlinc00460低表达组(n=30)linc00460高表达组(n=91)P性别 女571641 0.594 男641450年龄(岁) ≥60781860 0.633 <60431231T分期 T1762155<0.001 T228721 T317215N分期 N0822458<0.001 N1-339633miR-654-3p表达 高18171<0.001 低1031390

表2 121例食管癌患者的预后分析

Tab.2 Log-rank test of the 121 esophageal cancer patients

变量总生存期(月)P性别 女26.32±3.21 男25.31±2.18 0.82年龄(岁) ≥6027.13±2.99 <6023.18±3.35 0.72T分期 T131.21±3.19 T228.25±4.97 T317.33±4.21<0.05N分期 N032.17±3.77 N1-314.25±5.18<0.05Linc00460表达 高23.13±2.13 低28.55±3.62<0.05miR-654-3p表达 高33.29±1.35 低22.25±2.33 0.05

表3 121例食管癌患者建立COX模型

Tab.3 COX model for the 121 esophageal cancer patients

变量HRPN分期<0.05 N0Reference N1-33.28(2.19～4.51)Linc00460表达<0.05 低Reference 高6.18(4.89～8.33)miR-654-3p表达<0.05 低Reference 高0.37(0.19～0.58)

图2 121例食管鳞癌患者的nomogram

Fig.2 Nomogram of the 121 patients with esophageal squamous cell carcinoma

2.4 Linc00460及miR-654-3p在食管癌细胞中的表达及促癌功能Linc00460在食管癌细胞中高表达，而miR-654-3p则为低表达。CCK-8实验提示，敲除linc00460的Eca-109细胞的增殖能力显著降低；过表达miR-654-3p的Eca-109细胞的增殖能力显著降低；而敲除miR-654-3p的Eca-109细胞的增殖能力显著增强(图3)。

图3 Linc00460及miR-654-3p在食管癌细胞中的表达及对细胞增殖能力的影响

Fig.3 Expressions of linc00460 and miR-654-3p in esophageal cancer cells and the effects on proliferation

A、B：linc00460、miR-654-3p在食管癌细胞中的表达，***P<0.001；C～E：CCK-8实验检测敲除linc00460、过表达miR-654-3p及抑制miR-654-3p的Eca-109细胞的增殖能力。与control比较，***P<0.001。

2.5 Linc00460通过直接调控miR-654-3p发挥生物学功能敲除linc00460的miR-654-3p表达明显升高；而敲除和过表达miR-654-3p时，linc00460的表达未见明显改变(图4A～C)，提示miR-654-3p可能是linc00460的下游靶点。进一步双荧光素酶报告基因实验显示，linc00460的3′UTR区域与miR-654-3p直接结合(图4D)。

3 讨 论

越来越多的研究发现，LncRNA在肿瘤组织中异常表达，LncRNA在癌症中的作用一直备受关注[12]。国内外文献均证实lncRNA调控在ESCC的发生、发展中起着至关重要的作用，而且与患者的预后息息相关[13]。由此，人们提出lncRNA有成为肿瘤标志物的潜力。Linc00460位于染色体13q33.2，在多种肿瘤中高表达，例如结直肠癌、鼻咽癌、肺腺癌等[14-18]。YE等[19]学者通过分析TCGA肺腺癌数据库发现，linc00460过表达患者预后显著低于linc00460低表达的患者。进一步的生物学实验证明，敲除linc00460后可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖能力。

图4 Linc00460和miR-654-3p的互相调控关系

Fig.4 Regulation relationship between linc00460 and miR-654-3p

A：qRT-PCR检测敲除linc00460时miR-654-3p的表达；B：qRT-PCR检测敲除miR-654-3p时linc00460的表达；C：qRT-PCR检测过表达miR-654-3p时linc00460的表达；D：双荧光素酶报告基因实验检测linc00460与miR-654-3p直接结合。**P<0.01。

本研究发现linc00460在食管鳞癌中有促癌作用，提示linc00460可能为食管鳞癌的治疗提供新的靶点。

为明确linc00460在ESCC中作用的具体分子机制，本研究通过慢病毒转染技术敲除ESCC细胞中的linc00460。结果发现，食管鳞癌细胞增殖能力被显著抑制。考虑到lncRNA可作为竞争性内源性RNA(ceRNA)，通过竞争性结合microRNA，调控下游基因表达，影响相应生物学功能[20]。因此，我们依据生物信息学网站Starbase V2.0，Targetscan，预测发现linc00460与miR-654-3p的序列存在互补区域，即linc00460可能通过下调miR-654-3p发挥功能。进一步的细胞学实验发现，linc00460与miR-654-3p的表达存在负性关系。敲除linc00460后，miR-654-3p表达出现上升。双荧光素酶报告结果证实，linc00460与miR-654-3p存在直接结合关系。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20～24个核苷酸的小RNA，通过与其具有互补片段的mRNA，参与基因的转录后调控[21]。miR-654-3p在乳头状甲状腺癌及肺腺癌中均表现出抑癌功能[22-23]。本研究首次发现，miR-654-3p在ESCC中表达低于癌旁组织，这与miR-654-3p在其他肿瘤中所发挥的生物学功能一致。进一步生物学实验证明，过表达miR-654-3p可抑制ESCC细胞的增殖能力；在linc00460过表达的ESCC细胞中，其过表达可抑制linc00460的促癌能力，进一步证明linc00460/ miR-654-3通路参与了ESCC的发展。

本研究发现，linc00460高表达及miR-654-3p低表达可作为ESCC患者预后较差的指标。为了更好将基础研究结合于临床实践，本研究收集并整理了相应121例ESCC患者的临床病理资料，并依据linc00460及miR-654-3p的表达水平绘制nomogram图。nomogram图是对多因素COX回归的可视化表现，患者本人或临床医师可依据nomogram图对每一项危险因素进行评估，并预测每一位患者相应的3年或5年生存率。通过nomogram图结果，我们发现，miR-654-3p对食管鳞癌的预后贡献最大。一致性检验C-index提示该nomogram可信度良好。

本研究发现，linc00460通过与miR-654-3p直接结合下调miR-654-3p，促进ESCC的发生发展；此外，通过对121例ESCC患者绘制nomogram图，发现miR-654-3p对食管鳞癌的预后贡献最大。基于以上研究结果，后期研究可进一步探讨miR-654-3p及miR-654-3p下游靶基因在ESCC中所发挥的作用，进一步阐明linc00460/miR-654-3p的分子机制。