Toll样受体4在蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤中的作用及对海马区神经元自噬的影响

王一超，刘俊杰，刘海宁，王婧瑶，张婧曦，赵雅宁，李建民

(华北理工大学：1. 临床医学院实验中心；2. 附属医院神经外科，河北唐山 063000)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是神经外科急症中极具风险的疾病之一，虽然SAH只占所有脑卒中类型的5%，但约15%患者于院前发病死亡。即使在发达国家，SAH患者手术后30 d死亡率依然为30%～45%。50%的幸存患者也会留有不同程度的神经功能缺失后遗症。SAH极高的死亡率、致残率严重威胁人类的健康[1-2]。近年来，国内外对SAH后的早期脑损伤(early brain injury, EBI)研究较多，EBI是指SAH发生后72 h之内的一系列病理生理学损伤。目前，对EBI的颅内压骤升、血脑屏障的破坏、细胞凋亡与自噬、炎症因子的作用、兴奋性神经递质释放等有了初步研究[3-5]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是TLRs中报道最多的成员，能通过病原相关分子模式(PAMPs)识别病原体，还可以激活先天性的免疫系统并介导免疫过程[6]。近年来研究表明，自噬能够通过简单、快速的途径参与免疫反应[7]，并在免疫细胞平衡和免疫耐受中起作用。TLRs识别配体后，可以激活自噬反应作为一种直接清除胞内病原体的防御机制。本课题组前期研究已证实，SAH大鼠神经元自噬参与了EBI发生发展[8]。本研究以TLR4为调控靶点，通过对SAH大鼠应用CLI-095(TLR4抑制剂)进行干预，检测海马区TLR4的表达及自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达变化，为SAH发病机制及治疗方案提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠192只，体质量300～350 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[合格证号SCXK(京)2015-003]，饲养于华北理工大学动物实验中心，自然光照，温度适宜(24±2)℃。术前适应性喂养2周，自由进食水。按随机数字表法将SD大鼠分为假手术组、蛛网膜下腔出血模型组(模型组)、蛛网膜下腔出血+溶剂组(溶剂组)、蛛网膜下腔出血+TLR4抑制剂组(CLI-095组)，每组48只，其中12只用于行为学检测与干湿重法测定，12只用于HE染色，12只用于免疫组化，12只用于免疫印迹。每组再分为术后24 h、48 h两个时间点进行指标的检测。

1.2 试剂与仪器CLI-095购自InvivoGen公司，TLR4、Beclin1及LC3抗体均购自日本MBL公司，HRP标记的山羊抗兔IgG、SDS-PAGE 试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，DAB显色盒、PV6001试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显微手术器械(美国Fisher公司)，冰冻切片机(德国Leitz公司)，Olympus OX51正置相差显微镜(日本Olympus公司)，图像采集及分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 模型制备与给药方法釆用颈内动脉穿刺法[9]建立SAH模型，吸入麻醉诱导后仰卧固定于手术台，颈部正中切口备皮、消毒，逐层分离至暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。将ECA结扎并切断拉直，使其与ICA成一直线。取适当长度光纤并分别于20、25 mm处做好标记，将光纤从ECA插入ICA颅内段，插入深度为20 mm左右时会有阻力感，然后再向前3 mm穿破血管，将光纤拨出后迅速结扎ECA残端，恢复血流，缝合颈部皮肤。术中注意保暖。造模成功标准：术后观察双侧瞳孔不等大，剥离脑标本时发现血凝块分布在脑组织表面。假手术组操作同模型组，但不刺破血管。CLI-095组行SAH手术前6 h将大鼠麻醉固定，切开头皮并分离皮下组织，取适量100 mg/mL的双氧水擦试颅骨以充分暴露前囟的“十字交叉”骨性结构。侧脑室立体定位：Bregma点旁开0.9 mm，向后1.5 mm，并以彩笔标记。牙科钻钻孔注射100 μg/mL的CLI-095溶液10 μL。溶剂组手术操作同模型组，但向侧脑室注射DMSO溶液10 μL。

1.4 神经行为学检测依照Modified Garcia Score评分标准[10]，各组分别在术后24、48 h进行评估。评估内容：自发活动、四肢活动、前爪抓力、攀登运动、本体感觉和触须刺激反应。每项得分0～3分，总得分为3～18分。大鼠损伤越重，得分越少。

1.5 脑组织含水量检测用致死量的水合氯醛腹腔注射处死小鼠，立即断头取脑，去除皮质表面的硬脑膜、血渍后放于电子分析天平上(精确到0.1 mg)，称量脑组织湿重并记录。然后将脑组织放入电热恒温烘烤箱内，100 ℃烘烤24 h，置于电子天平上称量脑组织干重并记录。用干湿重法计算出脑含水量，脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%[11]。

1.6 HE染色观察海马CA1区神经元将各组大鼠在不同时间点麻醉，左心室灌注40 g/L多聚甲醛固定，断头取出脑组织，经脱水、透明、石蜡包埋后切片(片厚4 μm)备用。按照HE步骤进行染色、脱水、封片。各时间点取6个不同视野在光学显微镜(×400倍)下观察，计算存活神经元数量。

1.7 免疫组化法检测TLR4、LC3和Beclin1取上述步骤石蜡切片，按照PV二步法将切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐高压修复，滴加TLR4抗体(1∶300)于湿盒中过夜，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，DAB显色后，脱水、透明、封片。Beclin1(1∶300)、LC3(1∶250)检测方法同上。每个时间点随机选取4张切片镜下观察，每张切片任意选取6个不同视野(×400倍)，计算阳性细胞平均数。

1.8 Western blot检测TLR4、LC3和Beclin1的蛋白表达将各组大鼠在不同时间点麻醉后，于冰上迅速断头取脑，冷PBS冲洗3次，分离出干净的海马CA1区，匀浆、裂解后取上清。经BCA蛋白定量法测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳；以湿转法转至PVDF膜上；脱脂奶粉摇床封闭1 h；然后加入稀释好的TLR4一抗(1∶2 000)孵育过夜；洗膜后加入二抗(1∶2 000)反应2 h；PBS浸泡，以ECL显色，胶片曝光显影，结果用Image J软件进行吸光度值分析。LC3、Beclin1检测方法同上。

2 结 果

2.1 SAH大鼠神经功能评价结果应用Garcia评分标准对各组大鼠术后24、48 h神经功能评分的情况如图1。与假手术组相比，模型组大鼠神经功能评分在各个时间点均降低(P<0.05)；溶剂组各时间点评分结果与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，CLI-095组大鼠各时间点评分结果有所增高(P<0.05)，提示应用TLR4抑制剂后，在24 h和48 h时神经功能缺损情况有所改善，在一定程度上减轻了SAH大鼠的脑损伤。

2.2 脑组织含水量的检测结果依据干湿重法检测各组大鼠术后脑含水量情况如图2。SAH模型组大鼠各时间点脑含水量与假手术组脑含水量相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)；溶剂组大鼠在各个时间点脑含水量检测结果与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组大鼠各时间点脑含水量较模型组减少(P<0.05)。

图1 各组大鼠神经功能评分结果

Fig.1 Results of neurologic scores of the rats in each group

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图2 各组大鼠脑含水量的比较

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 海马CA1区HE染色结果光镜下，假手术组未见明显神经元病理改变，神经元排列整齐，形态正常，细胞质染色均匀，核仁清晰可见；模型组神经元水肿严重，可见坏死神经元，胞核胞质深染，核仁固缩，正常神经元数量减少(P<0.05)；溶剂组海马CA1区神经元变化与模型组变化差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组与模型组比较，CA1区神经元病理损伤程度好转，正常神经元数量减少，损伤情况减轻(P<0.05，图3，表1)。

2.4 各组大鼠海马CA1区TLR4蛋白组化结果假手术组海马CA1区可见少量TLR4蛋白阳性表达，主要表达于胞膜，呈棕黄色。模型组于术后24 h、48 h均可见TLR4阳性表达于胞膜，着色较深。与假手术组比较，模型组24 h和48 h的TLR4蛋白阳性细胞均增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；溶剂组TLR4蛋白的表达与模型组差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组与模型组比较，各个时间点的TLR4蛋白阳性表达均减少，差异均有统计学意义(P<0.05，图4，表2)。

图3 各组大鼠海马CA1区神经元HE染色

Fig.3 HE staining of neurons in hippocampus CA1 area of the rats in each group (×400)

A：假手术24 h组；B：模型组24 h组；C：溶剂组24 h组；D：CLI-095 24 h组；E：假手术48 h组；F：模型组48 h组；G：溶剂组48 h组；H：CLI-095 48 h组。

表1 各组大鼠海马CA1区存活神经元数目

组别n 24h48h假手术组6148.55±8.32150.73±5.23模型组656.55±2.88*40.25±1.42*溶剂组655.17±5.3239.86±6.27CLI-095组696.26±4.43△80.23±5.68△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

表2 各组大鼠海马CA1区TLR4蛋白表达

组别n 24h48h假手术组69.50±1.0810.00±1.45模型组624.50±3.15*48.67±6.19*溶剂组624.17±3.0648.50±3.27CLI-095组617.50±6.06△30.50±9.57△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

图4 各组大鼠海马CA1区TLR4免疫组化结果

Fig.4 The immunohistochemical results of TLR4 in hippocampus CA1 area in each group (×400)

A：假手术24 h组；B：模型组24 h组；C：溶剂组24 h组；D：CLI-095 24 h组；E：假手术48 h组；F：模型组48 h组；G：溶剂组48 h组；H：CLI-095 48 h组。

2.5 各组大鼠海马CA1区LC3、Beclin1蛋白组化结果LC3、Beclin1蛋白主要表达于细胞质，呈棕黄色或浅黄色。假手术组各时间点可见少量的阳性细胞表达，着色较浅；模型组各时间点LC3、Beclin1阳性表达增多；与假手术组比较，模型组24 h和48 h的蛋白阳性细胞均增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。溶剂组的LC3和Beclin1蛋白表达与模型组差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组与模型组比较，各个时间点的LC3、Beclin1蛋白阳性表达均减少，差异均有统计学意义(P<0.05，图5、图6，表3、表4)。

图5 各组大鼠海马CA1区LC3免疫组化结果

Fig.5 The immunohistochemical results of LC3 in hippocampus CA1 area in each group (×400)

A：假手术24 h组；B：模型组24 h组；C：溶剂组24 h组；D：CLI-095 24 h组；E：假手术48 h组；F：模型组48 h组；G：溶剂组48 h组；H：CLI-095 48 h组。

图6 各组大鼠海马CA1区Beclin1免疫组化结果

Fig.6 The immunohistochemical results of Beclin1 in hippocampus CA1 area in each group (×400)

A：假手术24 h组；B：模型组24 h组；C：溶剂组24 h组；D：CLI-095 24 h组；E：假手术48 h组；F：模型组48 h组；G：溶剂组48 h组；H：CLI-095 48 h组。

表3 各组大鼠海马CA1区LC3蛋白表达

组别n24h48h假手术组621.50±2.4222.33±1.47模型组645.72±1.93*98.68±2.82*溶剂组644.86±2.3598.50±3.05CLI-095组632.00±1.41△61.11±1.43△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

表4 各组大鼠海马CA1区Beclin1蛋白表达

组别n24h48h假手术组610.33±1.969.89±2.38模型组663.17±5.19*132.50±1.37*溶剂组664.27±5.73132.82±2.13CLI-095组633.16±3.12△92.86±2.33△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.6 各组大鼠海马CA1区TLR4蛋白Western blot结果假手术组TLR4蛋白仅有少量表达；模型组TLR4蛋白表达量在损伤后24 h和48 h均增高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，溶剂组TLR4蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组各时间点TLR4蛋白表达量比模型组减少(P<0.05，图7)。

2.7 各组大鼠海马CA1区LC3、Beclin1 Western blot结果假手术组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1在各时间点低表达且无明显变化；与假手术组比较，模型组各时间点LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达增多(P<0.05)；溶剂组在24 h、48 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；CLI-095组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1较模型组在伤后各时间点均降低，差异有统计学意义(P<0.05，图8、图9)。

图7 各组大鼠海马CA1区TLR4 Western blot结果

Fig.7 Western blot results of TLR4 in hippocampus CA1 area in each group

A-D分别为假手术组、模型组、溶剂组和CLI-095组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图8 各组大鼠海马CA1区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ Western blot结果

Fig.8 Western blot results of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ in hippocampus CA1 area in each group

A-D分别为假手术组、模型组、溶剂组和CLI-095组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图9 各组大鼠海马CA1区Beclin1 Western blot结果

Fig.9 Western blot results of Beclin1 in hippocampus CA1 area in each group

A-D分别为假手术组、模型组、溶剂组和CLI-095组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨 论

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)家族是MEDZHITOV[12]在1997年首次提出的，作为免疫防御的第一道天然防线，通过识别体外病原微生物表达的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)和体内各类细胞损伤释放的危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern, DAMPs)，从而启动级联信号传导，诱导炎症因子的大量释放，参与免疫应答[13-14]，维护机体内环境的稳定。迄今为止，已经发现了11种与人类相关的TLRs，其中TLR4是研究较多的成员。TLR4是典型的跨膜模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，分为胞外、胞内和跨膜区3部分。其中N-端胞外结构域负责识别PAMPs和DAMPs；跨膜区由21个半胱氨酸残基螺旋紧密连接，帮助TLR4定位于细胞膜[15]；C-端胞内TIR(Toll/IL-1 receptor)结构域识别不同的接头因子，分别通过依赖髓样分化蛋白88(MyD88)和依赖β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)进行信号转导。目前研究发现，TLR4在神经系统疾病EBI中表达上调，通过级联信号转导，参与疾病的病理生理过程。在脑缺血动物模型中发现[16]，缺血侧的神经元和小胶质细胞TLR4表达增多，参与并加重了脑缺血缺氧损伤。朱海波等[17]研究证实，敲除TLR4基因能抑制EBI中TLR4/MyD88/NF-κB相关蛋白的表达，减少炎症因子的过多释放，从而缓解脑水肿程度，减轻神经系统的损害。近期还有报道称SAH早期脑损伤中，TLR4/TRIF信号通路参与了神经细胞凋亡，而TLR4-MyD88途径介导了脑血管痉挛[18]。本实验结果显示，模型组大鼠24、48 h海马CA1区TLR4蛋白表达均上调，存活神经元数量减少，与此同时，Garcia评分较低，脑水肿程度加重，神经功能缺损明显；应用TLR4抑制剂(CLI-095)后，各时间点TLR4阳性表达较模型组减少，存活神经元数量增多，Garcia评分较模型组提高，脑水肿程度相应减轻。以上结果提示，TLR4蛋白参与并加重了SAH大鼠早期脑损伤过程，应用CLI-095后，对SAH大鼠出血早期阶段脑保护起到了一定的积极作用。

自噬(autophagy)是真核细胞内依赖溶酶体途径自我降解胞内容物的生物学过程，与多种神经系统疾病直接相关。自噬激活后产生的生物学效应及如何调控自噬一直是学者们热议的话题。刘涓等[19]敲降食管鳞癌(ESCC)细胞系TLR4后，LC3、AGT5、AGT7水平明显降低，说明TLR4能够促进ESCC自噬的激活。有研究指出，TLR4被TAK-242(resatorvid)抑制后，能明显降低TBI后海马神经元自噬，LC3、Beclin1表达降低，MyD88依赖和非依赖途径可能均参与其过程[20]。本研究还发现，假手术组神经元自噬处于基础水平，与自噬密切相关蛋白LC3、Beclin1表达较低；模型组大鼠早期脑损伤阶段，海马CA1区神经元自噬水平增强，测得LC3和Beclin1在24、48 h大量表达，这与我们先前之研究相一致[8]。TLR4被CLI-095抑制后，各时间点LC3、Beclin1表达较模型组均降低，提示TLR4蛋白可能介导了SAH大鼠海马CA1区自噬的发生、发展，CLI-095能够通过下调TLR4的表达降低海马CA1区神经元自噬水平。

综上，我们可以得出，TLR4蛋白参与并加重了SAH继发性脑损伤过程。同时，TLR4对SAH诱导的自噬发挥了调节作用。实验后期，本课题组将继续以TLR4为切入点，深入研究TLR4介导神经元自噬的途径，为SAH后EBI阶段研究寻找新的突破点。