miR-384-5p通过阻断BMP7转录后调控促进肾纤维化

张文静，孙吉平，吕 佳，李 燕，耿瀛洲，邵耀中，尹爱萍，路万虹

(西安交通大学第一附属医院肾内科，陕西西安 710061)

肾脏纤维化是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。无论是各种原发性肾小球疾病，还是糖尿病肾病、梗阻性肾病等，肾功能损害都与肾脏纤维化病变程度密切相关[1]。如何防治肾脏纤维化已成为当今肾病研究中的一个重要课题。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-7是转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGFβ)超家族的一员，并在肾脏中高表达，在小鼠体内BMP7基因缺失会导致肾发育损伤[2]。已经发现BMP7在肾小管上皮细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的调控中，通过e-钙黏连蛋白(一种关键的上皮细胞粘附分子)调节转化生长因子β1(TGFβ1)[3]。系统性应用重组BMP7可减轻肾小管上皮细胞的损害程度，并能减轻慢性肾损伤。最近研究发现EMT的调控中存在BMP7和TGFβ1信号通路的交叉作用[4-5]。但是，迄今为止有关BMP7在肾损伤中的分子调控机制仍未明确。

microRNAs(miRNAs)在生理和病理条件下(包括肾损伤)可调控多种蛋白的表达[6-7]。miRNAs是含有18～23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶基因mRNA的3′-未翻译区(3′-UTR)碱基配对来调节蛋白质水平[8-9]。miR-384-5p是miRNA家族的成员，已发现其通过PIK3CD在心脏保护中发挥重要作用，调控淀粉样前体蛋白及阿尔茨海默病相关的β-分泌酶的表达[10-12]。不过，到目前为止，miR-384-5p并没有被定义为BMP7靶向miRNA，而且它在肾损伤、肾纤维化和肾衰竭方面的作用尚不清楚。因此，本研究建立了小鼠单侧输尿管阻塞(unilateral ureteral obstructive, UUO)模型，通过miR-384-5p研究BMP7在肾小管上皮细胞间质转化中的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂选用12周的C57/6雄性小鼠(由西安交通大学医学部实验动物中心提供)。脂质体2000(Invirogen)，RIPA裂解液(Sigma)，兔BMP7和抗α-tubulin(Cell Signaling,San Jose, CA, USA)，HRP标记的抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA)，miRNeasy试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)，高容量逆转录DNA试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，PCR试剂盒(Qiagen)，位点突变的BMP7 3′-UTR(Creative BiogeneShirley, NY, USA)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)。

1.2 UUO模型的制作用6号丝线将12周C57/6雄性小鼠进行左侧输尿管结扎[13]，为UUO组，共20只；另设假手术组20只(未结扎)。术后3 d，每组处死10只小鼠分离出肾小管上皮细胞；术后14 d，每组再处死另外10只小鼠，观察肾组织纤维化程度及BMP7 mRNA和蛋白质表达情况。

1.3 肾脏纤维化的免疫组化及定量研究取UUO组和假手术组小鼠(正常对照)肾脏，常规制成5 μm厚石蜡切片，进行Masson染色。每张切片随机选择20个区域。阳性染色面积(蓝色)与整个区域的比值为肾脏纤维化程度。并检测BMP7 mRNA和蛋白质表达情况。

1.4 细胞分离、培养及处理按照已报道方法[14]将小鼠肾脏用流式细胞术荧光激活细胞分选(FACS)分离成单个细胞。分离肾包膜后切成2 mm的碎块，放入0.5 g/L胶原酶，270 r/min，37 ℃水浴摇床30 min；随后用40 nm的过滤器收集单个细胞，荧光素标记的抗E黏连蛋白孵育，通过流式细胞术分类荧光标记肾小管上皮细胞，用于后续的实时定量PCR或Western blot检测，或进行细胞培养(RPMI 1640培养基+100 mL/L胎牛血清+100 μg/mL青霉素+250 ng/mL的链霉素)。

1.5 miRNA靶点预测和3′-UTR荧光素酶活性分析由于miRNA是蛋白质最重要的转录后调控因子，对BMP7靶向miRNA进行生物信息学分析。筛选了满足下面两个条件的所有候选基因：靶向BMP7 mRNA；在肾脏中表达。用targetscan算法预测靶向BMP7的候选miRNA靶点，利用分子克隆技术构建荧光素酶报告基因。BMP7 3′-UTR靶序列以及在miR-384-5p结合位点存在突变的BMP7 3′-UTR(BMP7 3′-UTR mut)均购自Creative Biogene(Shirley, NY, USA)。

纯化的肾小管上皮细胞接种于24孔板培养24 h，之后共转染1 μg荧光素酶报告质粒和miR-384-5p-修饰的质粒。应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.6 质粒转染将表达miR-384-5p的质粒、表达反义miR-384-5p的质粒以及对照质粒分别通过脂质体2000(Invirogen)对肾小管上皮细胞转染(即miR-384-5p组、反义组、对照组)。培养肾小管上皮细胞消化分散、离心(1 000 r/min 5 min)后，用培养液重悬并计数后，每个35 mm培养皿加入0.8×106细胞，于CO2培养箱中培养，第2天进行转染。按脂质体体积(μL)∶DNA质量(μg)1∶2制备转染试剂。含有无血清培养基的试管中加入转染试剂后震荡，室温放置10～15 min；吸弃培养基并用PBS清洗细胞1次；加入含有转染试剂的培养基，培养箱中培养1 h。加入完全培养基继续培养48 h。再次进行细胞传代，按0.8×105个细胞/35 mm培养皿将细胞重新分入培养皿中，培养48 h后进行后续研究。

制作UUO模型时通过静脉注射空质粒(n=10)或反义-miR-384-5p质粒(n=10)，14周后处死小鼠，肾组织切片进行Masson染色来评估肾纤维化程度。

1.7 Western blot检测用添加蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液分别提取转染miR-384-5p组、反义组、对照组的细胞总蛋白，吹打混匀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清，BCA法测定总蛋白浓度，充分变性后加上样缓冲液，于SDS-PAGE变性凝胶进行电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，50 mL/L脱脂牛奶室温封闭1.5 h。分别用兔BMP7和抗α-tubulin 4 ℃孵育过夜(1∶100)，HRP标记的抗兔抗体(1∶100)孵育2 h。用ECL发光液在暗室进行压片、显影、曝光。

1.8 实时定量PCR检测使用miRNeasy 试剂盒提取总RNA，取2 μg RNA用高容量逆转录DNA试剂盒制备cDNA，用PCR试剂盒进行聚合酶链反应。所有引物购自Qiagen。基因相对表达水平由内参α-tubulin和实验对照确定。

1.9 统计学处理应用GraphPad Prism 6进行统计分析。实验数据用均数±标准差表示，多组比较用单因素方差分析法，用LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 UUO模型中BMP7 mRNA和蛋白的表达情况UUO组第14天肾纤维化显著增加(t=2.026，P<0.05)；肾组织的BMP7 mRNA表达显着增加(t=3.342，P<0.05)，但BMP蛋白表达没有增加(t=0.727、P>0.05，图1)。这提示UUO肾脏中可能存在BMP7的转录后调控过程。

图1 UUO模型制作及纤维化情况和BMP7 mRNA和蛋白的表达变化

Fig.1 UUO model established, renal fibrosis, and mRNA and protein expressions of BMP7

A：实验设计流程示意图；B：Masson染色显示小鼠肾纤维化程度(×200)；C：Masson染色定量结果(n=10，与Sham组比较，*P<0.05)；D：RT-qPCR检测结果(n=10，与Sham组比较，*P<0.05)；E：Western blot检测结果(n=10，与Sham组比较，NS：P>0.05)。

2.2 肾小管上皮细胞中miR-384-5p通过与BMP7 mRNA的3′-UTR直接结合进而抑制BMP7蛋白翻译targetscan算法预测靶向BMP7的候选miRNA包括：miR-384-5p、miR-30、miR-92和miR-128。然而，对BMP7靶向miRNA的双荧光素酶报告基因检测结果显示，在UUO模型制作前后miR-30、miR-92和miR-128的水平都非常低，表明其对BMP7的作用可能有限；而miR-384-5p水平最高，并且在UUO后的水平进一步升高(图2A)。生物信息学分析显示，miR-384-5p在BMP7 mRNA的3′-UTR处具有结合位点，位于第584位至第590位碱基位点处(图2B)。

在UUO后3 d通过FACS分选肾小管上皮细胞(图2C)。随后转染携带miR-384-5p的质粒或在CMV启动子控制下的反义miR-384-5p(as-miR-384-5p)，在纯化的肾小管上皮细胞中过表达miR-384-5p或者抑制miR-384-5p。通过RT-qPCR证实肾小管上皮细胞中miR-384-5p水平的改变(t=2.123，P<0.05，图2D)。结果表明，在肾小管上皮细胞中miR-384-5p通过与BMP7 mRNA的3′-UTR直接结合而抑制BMP7蛋白翻译。

图2 miR-384-5p结合BMP7 mRNA的3′-UTR抑制BMP7蛋白翻译

Fig.2 miR-384-5p binding to the 3′-UTR of BMP7 mRNA inhibited its translation into renal tubular epithelial cells

A：在UUO前后肾组织中BMP7靶向miRNA的水平；B：对BMP7 mRNA的野生型(wt)及突变体(mut)3′-UTR上的miR-384-5p结合位点的生物信息学分析；C：在UUO后3 d，基于E-cadherin(E-cad)的表达通过FACS对肾小管上皮细胞进行分选；D：用miR-384-5p质粒、反义miR-384-5p质粒转染肾小管上皮细胞，n=10,*P<0.05；E：肾小管上皮细胞中共转染1 μg 反义miR-384-5p(as-miR-384-5p)质粒和1 μg野生型 BMP7 3′-UTR或突变质粒，n=10,*P<0.05；F：肾小管上皮细胞中共转染1 μg miR-384-5p(miR-384-5p)质粒和1 μg野生型 BMP7 3′-UTR或突变质粒，n=10,*P<0.05。

2.3 肾小管上皮细胞中miR-384-5p对BMP7表达的影响检测发现miR-384-5p修饰并没有改变肾小管上皮细胞中BMP7 mRNA水平(t=-0.223，P>0.05，图3A)；miR-384-5p修饰的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白显著减少，而as-miR-384-5p修饰的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白显著增加(t=2.134，P<0.05，图3B)。提示肾小管上皮细胞中miR-384-5p确实能抑制BMP7蛋白翻译。

2.4 抑制miR-384-5p能减轻UUO诱导的肾脏损伤本研究结果显示，14 d时UUO组存在较强的纤维化，而在as-miR-384-5p组肾脏纤维化程度明显减弱(t=2.354，P<0.05，图4A～C)。尽管as-miR-384-5p处理组BMP7 mRNA没有改变(t=0.435，P>0.05)，但在as-miR-384-5p处理组小鼠的肾脏中BMP7蛋白显著增加(t=1.986，P<0.05，图4D、E)。这些结果提示抑制miR-384-5p能减轻UUO诱导的肾损伤。

3 讨 论

上皮-间质转化(EMT)是一个重要的生物学现象，在胚胎发育、肿瘤进展以及器官纤维化过程中发挥着关键作用。虽然许多信号通路在EMT进程中具有协同作用，但是TGFβ1仍被认为是肾小管上皮细胞EMT的主要诱因[15-16]。在肾小管上皮细胞中，BMP7治疗能逆转TGFβ1诱导的EMT，与内源性E-钙黏连蛋白再表达和上皮细胞表型的恢复有关[3]。已有报道，在多种疾病状态下，BMP7和TGFβ1之间存在拮抗作用[17-18]。在肾损伤后BMP7也是拮抗TGFβ1诱导的促纤维化作用的关键因子。然而，BMP7在肾损伤中的分子调控机制仍未确定。

图3 miR-384-5p-修饰对肾小管上皮细胞中BMP7表达的影响

Fig.3 miR-384-5p-modification changed the level of BMP7 protein in renal tubular epithelial cells

A：RT-qPCR检测结果；B：Western blot检测结果。n=10,*P<0.05。

本研究发现UUO模型中，BMP7蛋白水平并没有随着mRNA的表达增加而升高，提示BMP7转录后调控可能会减弱其对抗TGFβ1的效应。

抑制这种作用是否可以增加BMP7蛋白水平来拮抗TGFβ1的作用？由于miRNAs在蛋白质翻译过程中起着重要的作用，本研究使用生物信息学分析进行序列匹配，靶向BMP7候选miRNAs包括miR-384-5p、miR-30、miR-92以及miR-128。然而除了miR-84-5p外，在UUO前后，其余miRNA的水平非常低，这表明它们对BMP7的影响可能是有限的。另一方面，不仅在肾脏中可以检测到miR-384-5p水平，并且体外实验中也显示miR-384-5p靶向抑制BMP7。由于本研究使用的是原代肾小管上皮细胞，所以这些结果不会由细胞的特定功能导致。

图4 抑制miR-384-5p减轻UUO诱导的肾脏损伤

Fig.4 Inhibition of miR-384-5p alleviated UUO-induced renal injury

A：实验流程图；B、C：各组肾组织Masson染色图像和定量结果(×200)；D：RT-qPCR结果；E：Western blot结果。n=10,*P<0.05；NS：P>0.05。

BMP7 mRNA表达增加通过拮抗肾损伤后炎症巨噬细胞和成纤维细胞的TGFβ1表达增多而实现其可能的保护机制。然而，miR-384-5p的存在抑制了BMP7蛋白的平行增加。因此，本研究抑制miR-384-5p的作用，通过使用反义miRNA阻断BMP7的转录后调控，从而增加BMP7蛋白的水平并在肾纤维化发展中发挥肾脏保护作用。

综上所述，miR-384-5p通过与BMP7 mRNA的3′-UTR的直接结合抑制BMP7蛋白翻译，从而减弱BMP7蛋白对肾脏损伤的保护作用。miR-384-5p作为调节肾损伤后纤维化相关发病机制的关键因子，有希望成为预防肾纤维化的创新性治疗靶点。