不同乳酸杆菌肽聚糖对小鼠肠道黏膜的免疫调节作用

洪 亮，余方流，黄月娥

(皖南医学院 1.基础医学院；2.公共卫生学院，安徽 芜湖 241002)

乳酸杆菌(Lactobacillus bacillus)是一类可以发酵碳水化合物产生大量乳酸革兰阳性细菌的统称，有研究证实乳酸杆菌在抗肿瘤、抗感染、抗衰老等方面均具有明显的调节作用[1]。Sato等[2]认为，肽聚糖(peptidoglycan，PG)可能是乳酸杆菌发挥免疫赋活作用的主要功能性物质，PG能够通过增强巨噬细胞吞噬功能和诱导细胞因子释放，对机体免疫应答发挥重要影响。但在局部黏膜免疫中，关于乳酸杆菌PG成分的调节作用研究较少。本实验筛选4株乳酸杆菌提取细胞壁肽聚糖，探讨其对昆明小鼠局部黏膜免疫的调节机制，旨在为乳酸杆菌的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与菌种 健康昆明系小鼠50只，8～10周，雌雄各半，体质量20～25 g(购于南京医科大学医学实验动物中心)。4株乳酸杆菌从正常育龄妇女阴道内分离所得(皖南医学院微生物学与免疫学教研室提供)，经API-CH 50系统鉴定。

1.2 肽聚糖提取 将乳酸杆菌细菌培养后，调整菌液浓度为1010CFU/mL，迅速降温至4℃冰浴，在4℃，3000 r/min离心20 min收集菌体沉淀。反复洗涤沉淀，收集菌体，置于100℃沸水中灭活，4℃保存使用。釆用宋晓玲等改进的Prak三氯乙酸法提取肽聚糖[3]。

1.3 实验分组及处理 将实验动物按雌雄各半随机分为5组，分别为卷曲乳酸杆菌组(Group J)、嗜酸乳酸杆菌Ⅰ组(GroupⅠ)、嗜酸乳酸杆菌Ⅱ组(GroupⅡ)、嗜酸乳酸杆菌Ⅲ组(GroupⅢ)，另设对照组(Control)，每组均为10只。各试验组以100 mL /(kg·d)剂量灌服相应菌液提取物，对照组按同剂量灌服生理盐水，连续给药7 d。

1.4 免疫学指标检测 给药7 d后，小鼠断颈处死眼球采血，分离血清。用ELISA双抗体夹心法(试剂盒购于依科赛公司)检测血清TGF-β、IL-2、IL-6含量变化。另取小鼠小肠全段，用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗，离心去沉淀。用ELISA双抗体夹心法(试剂盒购于华美公司)检测SIgA含量变化。

2 结果

2.1 各组对IL-2的影响 结果显示，GroupⅡ组IL-2水平高于Group J和Control组(P<0.05)，GroupⅠ组IL-2水平高于Control组(P<0.05)；其他各组间IL-2水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组对IL-6的影响 结果显示，GroupⅡ、GroupⅠ和Group J组IL-6水平高于Control组(P<0.05)；而GroupⅢ 、GroupⅡ、GroupⅠ和Group J组间、GroupⅢ和Control组IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 各组对TGF-β的影响 结果显示，GroupⅢ和GroupⅡ组TGF-β水平高于GroupⅠ、Group J和Control组(P<0.05)；GroupⅠ组TGF-β水平高于Group J和Control组(P<0.05)；GroupⅢ和GroupⅡ组、Group J和Control组TGF-β水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 各组对SIgA的影响 结果显示，GroupⅡ组SIgA水平高于GroupⅢ、GroupⅠ、Group J和Control组(P<0.05)；GroupⅠ和Group J组SIgA水平高于GroupⅢ和Control组(P<0.05)，而GroupⅠ和Group J组SIgA水平差异无统计学意义(P>0.05)；GroupⅢ组SIgA水平高于Control组(P<0.05)。见表1。

表1 不同乳酸杆菌PG对昆明小鼠IL-2、IL-6、TGF-β和SIgA 分泌的影响 mg/L

GroupIL-2IL-6TGF-βSIgAControl20.510±1.635a16.733±3.473a177.998±18.978a283.386±26.767aGroup J21.576±2.249ab22.269±3.247b175.701±16.874a368.615±36.938cGroupⅠ24.052±2.974bc21.141±4.146b223.302±44.471b346.799±39.120cGroupⅡ25.409±3.478c22.360±4.568b277.737±27.647c394.426±22.254dGroupⅢ23.054±2.694abc17.996±2.724ab257.453±30.451c315.227±24.141bF5.2574.89424.46620.344P0.0010.0020.0000.000

注：多组间两两比较，符号完全不同表示P<0.05。

3 讨论

研究表明，本实验所选用的4株乳酸杆菌均具有黏膜免疫调节作用，且每种调节免疫的效果有一定的区别，它们具体的免疫调节机制并不是很清楚，但多个文献表明肽聚糖可能是乳酸杆菌发挥免疫赋活作用的主要功能性物质[4]。肽聚糖是存在于革兰阳性和阴性细菌细胞壁中的一种复合糖类，主链是β-1，4-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的杂多糖。肽聚糖是乳酸杆菌细胞壁的主要成分，肽聚糖与肽聚糖识别分子结合后可以通过不同的信号传导途径释放免疫调控物质来发挥免疫功能[5]。

黏膜免疫是机体局部免疫系统的重要组成部分，其中胃肠道黏膜组织是最大的黏膜免疫场所[6]。分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)的产生是肠黏膜免疫应答发生的重要标志之一，它由小肠上皮细胞分泌，能发挥免疫清除作用，提高肠道的黏膜免疫功能[7]。SIgA介导的免疫应答依赖Th细胞的辅助，其中Th分为Th1和Th2两类，Th1通过表达TGF-β、IL-2等介导细胞免疫应答；Th2通过表达IL-4、IL-6等介导体液免疫应答。这些细胞因子通过调节黏膜表面对相关抗原的免疫应答，具有重要免疫调节作用[8]。

本实验表明，4种乳酸杆菌均能上调SIgA表达，提示4种乳酸杆菌PG均能够诱导肠黏膜免疫应答。其中GroupⅡ的SIgA表达水平最高，Group J、GroupⅠ和GroupⅢ的SIgA表达水平次之。GroupⅡ和GroupⅠ均能提高IL-6、TGF-β和IL-2的表达，GroupⅢ能提高IL-6、TGF-β的表达，表明这3株乳酸杆菌的PG可能同时参与细胞免疫和体液免疫两条途径，从而促进SIgA的表达。而Group J只能提高IL-6的表达，表明其PG可能只通过参与体液免疫途径促进SIgA的表达。

本实验研究证明乳酸杆菌PG具有黏膜免疫调节作用，其可能机制是乳酸杆菌提供病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)——肽聚糖和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)，被Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)识别后，通过TIR区域向胞浆内传导信号，激活NF-KB等转录因子和蛋白酶，释放各类细胞因子、一氧化氮合成酶等，诱导细胞表面分子的表达，进而激活第一信号系统和第二信号系统，通过大量蛋白作用使特定炎性因子的表达减弱和某些抗炎性因子表达上调,在局部黏膜免疫中发挥作用[9]。本实验进一步证实不同的乳酸杆菌PG对局部免疫的调节作用途径和效果有差别，这为嗜酸乳杆菌微生态制剂及益生菌免疫佐剂的研究和开发提供依据。