芜湖市输入性登革热1例的实验诊断与分析

王 波，陈 潜，刘 淦，卢 莹，周 欢，杨进孙，孙恩涛

(1.皖南医学院 检验学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 感染性疾病科，安徽 芜湖 241001)

登革热由正链RNA登革病毒引起[1]，通过感染的埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播，于2013年被列为全球最重要的虫媒传染病之一[2]。登革热可由5种与基因有关的登革病毒血清型(DENV Ⅰ～Ⅴ)中的任何一种传染[3]。血清型Ⅰ～Ⅴ型依据E蛋白抗原性分类[4]，同一种登革热血清型的感染能提供长期的同型免疫，但只能提供暂时性的异型保护[5]。登革病毒血清型的分型在临床治疗和流行病学研究方面都具有其重要意义。本研究对1例输入性登革热患者的临床资料和实验诊断进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病史 患者，男，50岁，安徽芜湖人。患者自诉2018年8月27日在孟加拉期间，当地蚊子飞入口中，9月3日患者回国途中突发高热，达40℃,发热期间无皮疹出血，无头痛和全身酸痛。当地社区医院输液治疗效果不佳仍有低热。9月7日于弋矶山医院就诊，有咳嗽症状，无明显咳痰,出现腹痛、腹泻，腹泻约3～4次/天，稀便，全身乏力，纳差。

1.1.2 体格检查 T 37.7℃，F 68次/分钟，R 16次/分钟，BP 112/74 mmHg，体质量80 kg。发育正常，营养可，步入病室，神志清，精神欠佳，查体合作，对答切题。全身皮肤及黏膜无黄染，无皮疹。未见皮下出血，无肝掌，未见蜘蛛痣。

1.1.3 辅助检查 血常规:白细胞3.4×109/L，中性粒细胞79.9%,红细胞4.47×109/L,血小板80×109/L，胸片示基本正常，拟诊“登革热”。

1.2 实验室检测

1.2.1 病毒RNA提取 选用德国QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(货号：52906)提取RNA，并进行病毒核酸检测。

1.2.2 逆转录-巢氏PCR 以8 μL病毒RNA为模板，选用天根生化科技有限公司的FastKing RT Kit(With gDNase)试剂盒(目录号：KR116)，合成cDNA。巢氏PCR以上述cDNA为模板，参照文献[6]的反应体系和程序。引物序列见表1。

表1 登革病毒通用和血清分型引物

引物引物序列(5′→3′)扩增片段大小bp型特异性DVFTCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG通用DVRTTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC511(DVF和DVR)通用DV1 RCGTCTCAGTGATCCGGGGG482(DVF和DV1R)Ⅰ型DV2 RCGCCACAAGGGCCATGAACAG119(DVF和DV2R)Ⅱ型DV3 RTAACATCATCATGAGACAGAGC290(DVF和DV3R)Ⅲ型DV4 RCTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA392(DVF和DV4R)Ⅳ型

1.2.3 结果判断 取4 μL巢式PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果是否出现条带，再比对阳性条带与Ⅰ～Ⅳ型扩增片段大小是否有一致，若没有一致则为阴性。

1.2.4 基因克隆测序分析 将巢式PCR反应产物经纯化回收后进行克隆，阳性单克隆菌液送往上海生工有限公司测序，测序结果于NCBI上比对分析。

2 结果

2.1 电泳结果 巢氏PCR结果显示480 bp左右见一阳性条带(图1)。结合登革病毒通用和血清分型引物扩增片段大小，证实此次输入性登革热病例，且登革病毒血清型为I型。

M.marker;1.阴性对照;2.患者标本。

图1 患者巢氏PCR反应产物电泳图

巢氏PCR反应产物测序结果通过NCBI上BLIST比对，归属为DENV-I。

2.2 诊疗经过及疗效 确诊登革热感染后给予完善检查，治疗上予以抗病毒、抗感染、补液等对症治疗。2018年9月11日血常规示：血小板16×109/L，为防止出血，给予输注A(+)血小板1个治疗量，输入过程顺利，患者无寒战、皮疹、恶心等特殊不适。为防止出血，9月13日再次给予输入A(+)血小板2个治疗量，输入过程顺利，患者无特殊不适。

3 讨论

登革热的诊断主要依赖于临床症状的识别、血清学的确认以及患者的流行病学资料。目前，登革热的诊断通常是根据患者是否符合世卫组织定义的临床特征。这一定义具有一定的灵敏度但特异度较低[7]，存在一定的局限性，尤其是对于老年人的诊断。在世卫组织所列的登革热分类计划的症状中，登革热病例所符合的概率很高，因此，在应用于早期诊断时具有较高的灵敏度。然而，如肌痛、关节痛、黏膜出血等显示住院和重症登革热风险增加的症状在老年人中很少有报道，这一趋势降低了世卫组织分类办法对老年人的敏感性。研究表明，随着患者年龄的增加，临床对登革热的诊断变得更加困难[8]。同时登革病毒血清型间抗原特异性差异大，交叉免疫复杂[9]，且各血清型病毒毒力不一[10]。一种血清型的原发性感染只对感染的血清型提供终身免疫，但在再次感染另一种血清型时，反而会增加患者重症登革热疾病的风险[11]。

在我国，登革热主要流行于北纬29°以南的东南沿海地区，存在输入性病例和本地感染病例两种流行形式。输入性病例常年存在[12]，病例主要来源于东南亚和南亚[13]，而本次输入性病例来源地孟加拉正属于南亚地区。登革热在中国大陆的流行受地域和季节的限制，仍是一种输入性疾病，不被确认为地方病[14]。同时由于目前还没有针对登革热特定的治疗药物或者获得许可的疫苗[15]，遏制登革热传播的有效措施主要是抑制媒介种群和避免接触传染源。因此输入性病例的早期监测和分析，进而确定高风险地区和季节，对于规划登革热预防和控制的资源分配有重要意义。还可以利用监测数据建立登革热预警系统，为登革热控制政策的影响和公共卫生干预提供重要证据。

在本次输入性登革热病例的实验诊断和分析中，成功确诊该患者为登革热感染且确定其血清型分型为Ⅰ型。通过两对嵌套式引物的使用，极大提高了其检查的特异度和灵敏度，弥补了依赖临床症状诊断的不足。巢氏PCR检测不仅能够准确快捷地诊断登革病毒感染，检测血清分型，还能够通过对PCR产物测序，进行病毒血清型和基因多态性的分析，对于把握登革热流行的基本规律和风险评估具有重要意义。