绣球菌对肿瘤细胞的抑制作用

张作法，王富根，陈建飞，吕国英*

(1.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千岛湖兴宝菇业专业合作社，浙江 淳安 311701；3.衢州菇乐农业开发有限公司，浙江 衢州 324000)

绣球菌(Sparassiscrispa)属菌物界，担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，绣球菌科，也叫花椰菜菌、绣球蘑、地花蘑等。幼嫩的绣球菌子实体洁白细嫩、鲜美可口，野生分布较广，我国主要分布在黑龙江、吉林、西藏、云南、河北、福建、广东等林区中的云杉、冷杉或松林及混交林中；国外主要分布在日本、英国、美国、加拿大和澳大利亚等地。20世纪90年代绣球菌人工栽培在日本首获成功，被誉为梦幻神奇之菇，并进入商业性生产。

近年来，随着绣球菌人工栽培的成功，全球掀起了绣球菌的开发、应用和研究热潮，不少与其相关的产品已经面世。我国对绣球菌的研究起步较晚，仅涉及绣球菌生物学特性、保鲜和人工栽培技术方面的研究[1-3]。经研究发现，绣球菌具有抗肿瘤[4-5]、抗氧化[6]、免疫调节[7]、促进伤口愈合[8]等广泛的药理活性。然而，绣球菌的诸多研究特别是开发应用方面尚属空白。本研究比较了绣球菌水提物对4种常见的肿瘤细胞(人肺癌A549、人胃癌SGC-7901、人胰腺癌PANC-1和人肝癌HepG2)的抑制作用，以期为绣球菌产品的开发提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和耗材

DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司，批号AD20616263)，DMEM基础培养基(美国gibco公司，批号8118196)，1640培养基(美国gibco公司，批号8117177)，胎牛血清(杭州四季青公司，批号18040302)，胰酶(美国gibco公司，批号1953147)，MTT(ST316)，PBS(C0221A)和DMSO (ST038)均购于碧云天生物技术公司。

1.2 瘤株

人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC-7901、人胰腺癌细胞PANC-1、人肺癌细胞A549购于浙江省医学科学院。

1.3 水提物

水提物制备：称取适量干燥绣球菌粉，置于圆底烧瓶中，加入50倍体积的蒸馏水，置于90 ℃的水浴锅内浸提3 h，离心后，合并提取液。并将提取液经旋转蒸发器浓缩至200 mg·mL-1，高温高压灭菌后，4 ℃保存备用。

1.4 仪器

BS124S电子天平，美国赛多利斯公司；DKB-600A型电热恒温水槽，上海森信实验仪器公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TDL-40C低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；Thermo 3111培养箱，美国赛默飞公司；Synergy-2 SLFPA全波长多功能酶标仪，美国伯腾公司；DMI3000B倒置显微镜，美国莱卡公司。

1.5 实验方法

选择4种人肿瘤细胞(人胰腺癌细胞PANC-1、人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞A549)，采用DMEM培养基或RPMI1640(含10%胎牛血清)培养，37 ℃、5% CO2条件下传代培养。MTT法[9]检测肿瘤细胞的存活率：调整细胞为5×104mL-1，100 μL·孔-1接种于96孔板中。设立空白组、正常对照组、系列不同浓度药物组，每孔加入含药物培养基100 μL，于37 ℃，5% CO2培养箱中分别培养24和48 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL继续培养4 h。以移液枪小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，室温置于摇床10 min，于酶标仪490 nm测定D值，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。增殖抑制率(%)=1-(D样品-D空白)/(D对照-D空白)×100。同时倒置显微镜观察细胞形态采用物镜20×，拍照记录各组细胞形态。

1.6 数据处理

数据采用SPSS 软件进行分析，P<0.05为统计学上有显著差异，样本数n≥3。

2 结果与分析

绣球菌水提物在0～6.4 mg·mL-1剂量下24和48 h时对4种肿瘤细胞存活率的影响，MTT结果如表1、表2所示。24 h时，当绣球菌多糖浓度在1.2 mg·mL-1时人胃癌SGC-7901细胞存活率与人胰腺癌PANC-1细胞接近，随着浓度升高对细胞增殖抑制作用增强，均强于人肝癌HepG2和人肺癌A549。48 h时，当绣球菌多糖浓度在0.4 mg·mL-1时，人胃癌SGC-7901与人胰腺癌PANC-1细胞存活率均与正常组有显著性差异，随着浓度升高对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用高于人胰腺癌PANC-1细胞。

表1 绣球菌水提物在24 h时对4种肿瘤细胞抑制率的影响 单位：%

注：*、**分别表示与空白对照相比，差异达显著(P<0.05)、极显著水平(P<0.01)。表2同。

表2 绣球菌水提物在48 h时对4种肿瘤细胞抑制率的影响 单位：%

随着药物浓度增加和作用时间延长，光镜下观察人肺癌A549和人胃癌SGC-7901细胞数量减少，皱缩，变圆，贴壁不紧密，部分脱落，形态损伤程度逐渐加深(图1～4)。绣球菌水提物浓度在6.4 mg·mL-1时作用48 h，对人肝癌HepG2细胞抑制率约89%，人肺癌A549约32%，人胰腺癌PANC-1约68%，人胃癌SGC-7901约49%。48 h时，绣球菌多糖对人肺癌A549和人胃癌SGC-7901细胞的IC50分别为5.016和6.981 mg·mL-1。

可见在本实验条件下，高浓度时，绣球菌水提物对4种肿瘤细胞增殖的抑制作用由强到弱依次表现为：人肺癌A549>人胃癌SGC-7901>人胰腺癌PANC-1>人肝癌HepG2；低浓度时，绣球菌多糖对人胃癌SGC-7901的抑制作用强于人肺癌A549细胞。

A～H依次表示0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4 mg·mL-1。图2～4同。图1 绣球菌水提物24 h对人胃癌细胞SGC-7901光镜下形态的影响(200×)

图2 绣球菌水提物48 h对人胃癌SGC-7901细胞光镜下形态的影响(200×)

图3 绣球菌水提物24 h对人肺癌A549细胞光镜下形态的影响(200×)

图4 绣球菌水提物48 h对人肺癌A549细胞光镜下形态的影响(200×)

3 讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的主要疾病之一，为全球人类死亡的第二大原因。目前药物治疗是肿瘤综合治疗的重要手段之一。从天然动植物或菌类中提取的天然活性物质是抗癌药物的重要来源。MTT法是1983年Mosmann提出的用于快速测量细胞增殖、细胞活性及细胞毒性的方法，因其价格低廉、简单灵敏而被广泛用于抗肿瘤药物筛选[10]。菌类食品的营养价值介于动物性食品和植物性食品之间，兼具动物食品的高蛋白和植物食品的低脂肪的优点。随着社会的进步和国民生活水平的提高，人们对饮食的绿色、天然和保健功能的追求越来越高，绿色、天然、功能性菌类食品越来越受到消费者的青睐。

绣球菌香味怡人，口感鲜美，是国内外美食家公认的山珍美味。同时其营养、保健价值高，富含β-葡聚糖、腺嘌呤核苷、麦角固醇、超氧化物歧化酶等多重营养成分，因而具有强身健体、防癌抗癌的特殊功能，同时具有抗衰老、美容等功效，对高血压、糖尿病等疾病的预防及改善有很大的作用，是一种药食兼用的珍稀菌类。

葡聚糖是由葡萄糖单体聚合而成的多糖，分为α型和β型，α型葡聚糖作为机体能量的主要来源，不具备生物活性。β型葡聚糖是一种生物活性物质，具有广泛的药理活性。多糖是绣球菌中的主要活性物质，据日本食品分析中心报道，绣球菌中的β型葡聚糖含量达到43.6%，比灵芝和姬松茸高出3～4倍，其含量为菇类之最。

目前对于绣球菌的抗肿瘤作用已经进行了广泛的研究，Hasegawa等[11]研究发现，绣球菌粉能够显著减小荷瘤S-180小鼠的肉瘤大小，且生命延长。Ohno等[12]对14例癌症患者进行口服绣球菌粉临床实验，其中9例病人病情得到了缓解。Harada等[13]发现，绣球菌β-葡聚糖对肺癌、乳腺癌、胃癌等有明显的抑制作用。Yamamoto等[14]发现，绣球菌多糖能够有效抑制血管生成和转移。同时有研究还表明，绣球菌多糖的抗肿瘤机制是刺激细胞因子的产生来对抗肿瘤[15]。宋文荣等[16]研究了绣球菌超细粉能够通过改善机体免疫力和抗氧化作用来达到对H22荷瘤小鼠的抑制作用。于韦韦[17]发现，绣球菌多糖能通过线粒体凋亡通路诱导乳腺癌细胞凋亡，并通过诱导免疫因子的分泌实现对肿瘤细胞的抑制和杀伤。Rui等[18]研究表明，用绣球菌具有良好的抗肿瘤效果。Kim等[19]研究发现，绣球菌的葡聚糖能够通过激活巨噬细胞和树状突细胞来提高抗肿瘤效果。

本实验经MTT法检测发现，绣球菌水提物对不同组织来源的肿瘤细胞均有一定的增殖抑制作用，其中对人肺癌A549细胞抑制作用最强，对人肝癌HepG2抑制作用最弱，表明其具有一定的组织选择性。据测定，绣球菌中的β葡聚糖含量达到了40%以上，而水提物中以多糖类物质为主，考虑到β-葡聚糖卓越的药理活性，所以水提物中的β-葡聚糖起到重要的作用。由于水提物成分复杂，具体起作用活性物质的鉴定及抗肿瘤的作用机理将是下一步研究的重点。