Ti4+固载的纳米复合硅球的制备及其在磷酸化蛋白分离富集中的应用

谢 青，胡巧云，郑 琼，林子俺*

(1.福建生物工程职业技术学院 药学系，福建 福州 350002；2.福州大学 化学学院 食品安全与生物分析教育部重点实验室，福建 福州 350116)

蛋白质磷酸化是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。研究表明，蛋白质磷酸化的异常表达与癌症、白血病等疾病密切相关[1]。因此，研究蛋白质磷酸化对于一些重大疾病的早期诊断极为重要。由于磷酸化蛋白在生物样品中丰度较低且易受到高丰度非磷酸化蛋白的干扰，以现有的技术手段难以对磷酸化蛋白进行直接检测，因此亟待发展一种高效的磷酸化蛋白富集方法。目前，磷酸化蛋白的富集方法主要有固定离子亲和色谱、金属氧化物亲和色谱、亲水色谱、亲和免疫法等[2-6]。固定金属离子亲和色谱(IMAC)[7-11]因其强特异性而备受科研工作者的青睐。相比于传统的镓、铝、铁等三价离子，钛离子(Ti4+)、锆离子(Zr4+)具有更多的磷酸化蛋白结合位点，已被广泛应用于磷酸化蛋白的分离富集。

点击化学(Click chemistry)由Sharpless于2001年首次提出[12]，具有效率高、副反应少、分离提纯简单、环境污染小等优点，已被广泛应用于表面修饰、生物大分子、DNAs、生物与化学传感器等领域[13-15]。“巯-烯”反应作为点击化学中的一种，具有无需金属催化、简便高效、便捷可控、后处理方便且对水、氧不敏感等优点，逐渐成为化合物改性和聚合物固化反应的有效途径[16-18]。 “一锅法”(“one-pot”)[19-20]是一种简便的有机合成方法，可同时进行多步反应而无需将产物分离，在经济上和环境上较为友好，应用广泛。将“一锅法”引入磷酸化蛋白分离富集材料制备，可极大地简化合成过程。基于“巯-烯”点击反应的磷酸化蛋白分离富集材料的“一锅法”制备，目前尚未见报道。

基于此，本文结合简便高效的“巯-烯”点击反应与“一锅法”，制备了一种固载Ti4+的纳米二氧化硅复合材料(SiO2-Ti4+)，在金属离子亲和色谱的基础上，将其应用于磷酸化蛋白的选择性分离富集。该亲和材料在最优条件下对α-酪蛋白具有良好的富集效果，并成功应用于牛奶实际样品中磷酸化蛋白的分离富集，表现出良好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2450紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)，Tecnai G20透射电子显微镜(荷兰FEI公司)，ESCALAB250 X射线光电子能谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Nicolet 6700傅立叶红外光谱仪(美国Nicolet公司)，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)仪(美国Bio-Rad公司)。

四乙氧基硅烷(TEOS)、γ-巯丙基三甲氧基硅烷(γ-MPTS)、硫酸钛、辣根过氧化物酶(HRP，Mw44 kDa，pI 7.2)、乙烯基膦酸(VPA)、α-酪蛋白(α-Casein，Mw22～25 kDa，pI 4.2～4.7)、β-酪蛋白(β-Casein，Mw24 kDa，pI 4.6～5.1)、鸡蛋卵清白蛋白(OVA，Mw44.3 kDa，pI 4.6)、牛血清白蛋白(BSA，Mw66 kDa，pI 4.9)、转铁白蛋白(Trf，Mw80 kDa，pI 5.5)均购自Sigma公司。其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏纯制水。

1.2 SiO2-Ti4+纳米复合材料的制备

采用Stöber法制备二氧化硅纳米粒子：首先将40 mL无水乙醇、1.28 mL浓氨水和1.6 mL二次水加入到三颈烧瓶内混合均匀，磁力搅拌条件下加入2.4 mL TEOS和0.3 mLγ-MPTS，30 ℃水浴条件下反应24 h。

利用“巯-烯”点击反应，将磷酸基修饰到硅球表面，步骤如下：向反应完全的硅球溶液中依次加入20 mL水、100 μL VPA和质量分数为1%的偶氮二异丁腈(AIBN)，氮吹20 min后，于75 ℃水浴条件下反应12 h。反应结束后，将所得纳米二氧化硅复合材料离心并用二次水清洗若干次，60 ℃下真空干燥6 h。

合成SiO2-Ti4+材料：称取50 mg纳米二氧化硅复合材料溶于15 mL Ti(SO4)2水溶液(0.1 mol/L)中，反应1 h，使磷酸根与Ti4+反应完全。将固定上Ti4+的纳米复合材料离心，并用二次水洗涤若干次，60 ℃真空干燥备用。

1.3 SiO2-Ti4+纳米复合材料吸附性能考察

分别测定SiO2-Ti4+材料对不同浓度磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的吸附量，作等温吸附曲线：平行称取36份SiO2-Ti4+材料0.5 mg置于2 mL离心管中，分别加入500 μL质量浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的α-casein、β-casein、OVA、HRP、Trf、BSA溶液(蛋白溶液均用含0.2 mol/L NaCl的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS,0.01 mol/L，pH 6.0)缓冲溶液配制)，超声使其均匀分散，室温下吸附2 h。离心后，在波长280 nm和403 nm处测定上清液的吸光度。进行3次平行实验，取平均值。

考察SiO2-Ti4+材料对不同蛋白在不同时间段的吸附量Q，制作吸附动力学曲线：分别称取0.5 mg SiO2-Ti4+材料各42份，加入0.5 mg/mL的α-casein、β-casein、OVA、HRP、Trf、BSA溶液(蛋白溶液制备方法同上)各500 μL，室温下超声振荡，按间隔时间段(3、15、30、45、60、90、120 min)离心取上清液，测其在280 nm和403 nm波长处的吸光度值，计算出不同蛋白在不同时间段的吸附量Q，以吸附量Q对吸附时间t作图。

以糖蛋白HRP作为竞争蛋白进行竞争吸附实验：称取0.5 mg SiO2-Ti4+材料于离心管中，取质量浓度为0.5 mg/mL的β-casein和0.5 mg/mL的HRP混合溶液(体积比1∶1)500 μL。室温下超声分散并孵育2 h后，离心取上清液，用紫外-可见分光光度计在波长280 nm和403 nm处测其吸光度值，根据溶液吸附前后蛋白质浓度的变化，利用吸光度加合法计算吸附前后蛋白质的浓度，得出SiO2-Ti4+材料对两种竞争蛋白的吸附量。

1.4 样品制备与SDS-PAGE凝胶电泳实验

模拟蛋白质混合样的制备：配制β-casein(0.5 mg/mL)和 HRP(0.2 mg/mL)的混合液(体积比1∶1)5 mL，于4 ℃冰箱保存备用。

实际样品制备：定量移取100 μL伊利牛奶于10 mL离心管中，用含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01 mol/L，pH 6.0)缓冲溶液稀释60倍，于4 ℃冰箱保存备用。

准确称取SiO2-Ti4+材料1.0 mg和2.0 mg，分别加入500 μL的模拟蛋白质混合样、稀释60倍的牛奶样品，室温下超声振荡2 h并离心，取其上清液，待SDS-PAGE凝胶电泳分析。另外，依次采用50%乙腈、1%三氟乙酸、二次水洗涤两次，去除非特异性吸附的蛋白，然后用10%的氨水100 μL洗脱SiO2-Ti4+材料特异性吸附的磷酸化蛋白，离心并取其上清液，待SDS-PAGE凝胶电泳分析。

实验采用5%浓缩胶与12%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，上样量均为10 μL，以考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色，使用乙醇-乙酸-水溶液(V乙醇∶V乙酸∶V水=1∶1∶8)进行脱色。

2 结果与讨论

2.1 SiO2-Ti4+材料的表征

分别采用透射电镜、红外光谱(FT-IR)和X 射线电子能谱(XPS)对所合成的SiO2-Ti4+复合材料进行表征。如图1所示，硅球呈现规整的球形结构，粒径均一，分散性好，用nano meaturer软件统计得到的粒径约为66 nm。

从红外谱图(图2A)可以判断，1 098、798 cm-1处为Si—O—Si的振动吸收峰，2 925 cm-1处为—CH2的伸缩振动峰。1 161 cm-1处出现的吸收峰为P—O的伸缩振动峰，该峰属于乙烯基膦酸的特征吸收峰，表明乙烯基膦酸已成功地键合到SiO2纳米粒子表面。XPS谱图(图2B)表明所合成材料中含有 C、O、Si和Ti 元素。P2p在133 eV处的峰较弱，可能是因为XPS测得的只是SiO2-Ti4+材料表面的元素含量。Ti和P的峰证明Ti4+成功固载于纳米复合硅球的表面。

图3 pH值对SiO2-Ti4+材料吸附性能的影响Fig.3 Effect of pH value on adsorption properties of SiO2-Ti4+ nanocomposites

2.2 SiO2-Ti4+材料的吸附性能

实验考察了SiO2-Ti4+材料在不同pH值条件下对蛋白的吸附效果。从图3可以看出，该材料在pH 6.0的缓冲溶液条件下对磷酸化蛋白具有最高的吸附量，且不同pH值下SiO2-Ti4+材料对β-casein的吸附量均明显高于HRP和BSA，说明材料表面的Ti4+对磷酸化蛋白中的磷酸基团有很强的亲和力。将0.5 mg SiO2-Ti4+材料加入到500 μL 含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01 mol/L，pH 6.0)缓冲溶液中，再加入一系列不同浓度的蛋白质溶液，孵育2 h。从吸附等温线(图4A)可以看出，复合材料对磷酸化蛋白(α-casein、β-casein和OVA)的吸附量随着蛋白质量浓度的增大而增大，当蛋白质量浓度达0.5 mg/mL时，吸附基本趋于平衡。计算可得α-casein，β-casein和OVA的最大吸附量分别为12.27、10.13、5.47 μmol/g。而在同等条件下，该材料对非磷酸化蛋白(Trf，HRP和BSA)的吸附量变化不大，在蛋白质量浓度为0.2 mg/mL时，吸附已基本达到饱和，此时Trf、HRP和BSA的吸附量分别为1.60、1.12、1.46 μmol/g。以上数据说明SiO2-Ti4+材料对磷酸化蛋白进行了选择性的富集且吸附量较大。通过吸附动力学曲线考察了SiO2-Ti4+材料对蛋白的吸附速率。从图4B可知，SiO2-Ti4+对蛋白均具有较快的吸附速率，但由于Ti4+与磷酸化蛋白的亲和作用需一定的时间，因此在30 min左右才基本达到饱和吸附。而对于非磷酸化蛋白，主要依靠的是纳米复合材料与蛋白的非特异吸附作用，因此呈现扩散性吸附，吸附速率快且吸附量随时间的变化不明显。

图4 SiO2-Ti4+材料对蛋白的吸附等温线(A)及吸附动力学曲线(B)Fig.4 Adsorption isotherms of protein by SiO2-Ti4+ nanocomposites(A) and kinetics of protein adsorption onto SiO2-Ti4+ nanocomposites(B)

为了验证SiO2-Ti4+材料在混合溶液中对磷酸化蛋白的特异性识别性能，本实验选择HRP作为竞争蛋白，取1.0 mg SiO2-Ti4+材料及0.5 mg/mL蛋白质溶液加入到1 mL含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01mol/L，pH 6.0)缓冲溶液中，孵育1 h，结果如图5A所示。从图中可以看出，SiO2-Ti4+材料对β-casein的吸附量明显大于HRP，说明该材料在竞争蛋白存在的条件下，仍对磷酸化蛋白具有很好的吸附效果和识别性能。

纳米复合材料的重复利用也是材料性能的一个重要指标，稳定性好的材料可以多次使用，降低成本。将SiO2-Ti4+材料经吸附1 h、10%的氨水洗脱、重吸附，如此循环使用后，检测其对β-casein的吸附效果，进行3次平行实验，取平均值。由图5B可知，经过6个循环后，吸附量有所降低，主要的原因可能是，在实验过程中经离心和洗脱后，材料表面的Ti4+有轻微脱落，且在离心过程中存在着难以避免的材料损失。但总体上，材料的稳定性良好，可重复利用。

2.3 SiO2-Ti4+材料对样品中磷酸化蛋白的富集

通过SDS-PAGE凝胶电泳考察材料在混合溶液中对磷酸化蛋白的选择性分离效果，采用5%浓缩胶与12%分离胶，结果如图6A所示。

可以看出，条带2为吸附之前的混合样(α-casein+HRP)，条带3为SiO2-Ti4+材料吸附后的上清液。对比可知，α-casein几乎被SiO2-Ti4+材料完全吸附，而HRP则很少被吸附。条带4为SiO2-Ti4+材料上洗脱下来的蛋白电泳谱图，在通过50%乙腈和1%三氟乙酸洗脱非特异吸附的蛋白后，仅出现了α-casein电泳条带，而未出现HRP蛋白的条带，表明SiO2-Ti4+材料能从混合样中选择性地分离富集α-casein。将制得的SiO2-Ti4+材料应用于牛奶实际样品的分析(图6B)，条带2为稀释60倍的牛奶电泳谱图，蛋白分子量从大到小依次出现了α-酪蛋白(α-casein)、β-酪蛋白(β-casein)、β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)，条带3为经SiO2-Ti4+材料吸附后的上清液，与条带2相比，条带3上磷酸化蛋白α-casein和β-casein的电泳条带基本消失，其他区域的非磷酸化蛋白无显著变化。证实了SiO2-Ti4+材料可以选择性地分离富集牛奶样品中的磷酸化蛋白。条带 4为SiO2-Ti4+材料洗脱后的电泳谱图。与条带 2相比，条带4中有磷酸化蛋白α-casein和β-casein的电泳条带，而未出现非磷酸化β-Lg和α-La。上述实验结果充分表明，本实验方法制得的SiO2-Ti4+材料对磷酸化蛋白具有良好的选择性识别作用，可以用于复杂样品中磷酸化蛋白的选择性分离和富集。

3 结 论

本文结合“巯-烯”点击反应和“一锅法”，成功制备了SiO2-Ti4+纳米复合材料，并用于选择性分离富集磷酸化蛋白。该材料制备过程简单方便，条件温和。实验结果表明该材料具有较好的形貌特征，粒径均一，分散性好，并且对磷酸化蛋白具有良好的吸附效果。将该材料应用于复杂实际样品中磷酸化蛋白的选择性分离富集，也获得了令人满意的结果。该材料有望在蛋白质组学领域得到更广泛的应用。